【摘要】： 第一部分HMGB1酸性尾端抗菌相關(guān)功能位點(diǎn)解析 研究目的:高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box-1,HMGB1)屬高遷移率族蛋白超家族成員,由A box、B box及酸性尾端三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成,其廣泛存在于真核細(xì)胞核內(nèi),也可存在于胞漿及細(xì)胞外等多個(gè)部位,在機(jī)體正常生理活動維持和某些疾病狀態(tài)下發(fā)揮多種重要功能。相對于其他功能而言,抗菌活性是HMGB1的一項(xiàng)新功能。我們前期在對HMGB1功能機(jī)制進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn):重組人HMGB1具有抗菌活性,然而缺失由30個(gè)氨基酸殘基組成的酸性尾端的突變體蛋白則喪失抗菌能力;另外,我們還證實(shí)了單獨(dú)的A box和B box不具有抗菌活性。因此,HMGB1酸性尾端對其抗菌活性的發(fā)揮至關(guān)重要。但是,針對我們獲得的這一新發(fā)現(xiàn),至少還有兩個(gè)問題需進(jìn)一步探討:酸性尾端區(qū)域中參與抗菌作用的詳細(xì)功能位點(diǎn)尚待解析;單獨(dú)的酸性尾端是否即有抗菌能力還有待鑒定。本部分實(shí)驗(yàn)旨在尋找HMGB1酸性尾端中抗菌相關(guān)功能位點(diǎn),并觀察單獨(dú)酸性尾端的抗菌活性。 方法及結(jié)果: 1.人HMGB1酸性尾端不同位點(diǎn)缺失突變體的制備 (1)用已克隆于pUC19載體中測序正確的、編碼人HMGB1的cDNA為模板,經(jīng)常規(guī)PCR或一步反向PCR致突變策略分別擴(kuò)增得到11種人HMGB1酸性尾端不同位點(diǎn)缺失突變體蛋白的編碼序列,并成功的構(gòu)建了重組質(zhì)粒:pUC19/mHMGB1 -211-215、pUC19/mHMGB1 -206-215、pUC19/mHMGB1 -201-215、pUC19/mHMGB1 -196-215、pUC19/mHMGB1 -191-215、pUC19/mHMGB1 -186-200、pUC19/mHMGB1 -196-210、pUC19/mHMGB1 -196-205、pUC19/mHMGB1 -198-207、pUC19/mHMGB1 -201-210、pUC19/mHMGB1 -201-205。 (2)將上述測序正確的各突變體編碼序列分別亞克隆到適于表達(dá)毒性蛋白的原核表達(dá)載體pQE-80L中,成功地構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pQE-80L/mHMGB1 -211-215、pQE-80L/mHMGB1 -206-215、pQE-80L/mHMGB1 -201-215、pQE-80L/mHMGB1 -196-215、pQE-80L/mHMGB1 -191-215、pQE-80L/mHMGB1 -186-200、pQE-80L/mHMGB1-196-210、pQE-80L/mHMGB1 -196-205、pQE-80L/mHMGB1 -198-207、pQE-80L/mHMGB1 -201-210、pQE-80L/mHMGB1 -201-205。 (3)將上述重組原核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化于大腸桿菌DH5α,在終濃度0.5mmol/L的IPTG、37℃誘導(dǎo)表達(dá)3h。SDS-PAGE分析可見,目的蛋白相對分子質(zhì)量均在30kDa- 25kDa之間,均主要以分泌形式表達(dá)。經(jīng)Ni2+-NTA系統(tǒng)有效純化后,我們成功的制備了11種人HMGB1酸性尾端不同位點(diǎn)缺失的突變體蛋白:mHMGB1 -211-215、mHMGB1 -206-215、mHMGB1 -201-215、mHMGB1 -196-215、mHMGB1 -191-215、mHMGB1 -186-200、mHMGB1 -196-210、mHMGB1 -196-205、mHMGB1 -198-207、mHMGB1 -201-210、mHMGB1 -201-205。 2.人HMGB1酸性尾端不同位點(diǎn)缺失突變體抗菌功能的檢測與比較 體外抗菌實(shí)驗(yàn)(試管稀釋法、瓊脂擴(kuò)散法)結(jié)果證實(shí):11種人HMGB1酸性尾端不同位點(diǎn)缺失突變體中mHMGB1 -211-215、mHMGB1 -206-215、mHMGB1 -186-200對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌JM109、ATCC25922、DH5α具有不同程度的抗菌活性,其中對DH5α抗菌活性最弱;而對綠膿桿菌則無此抗菌活性。其余突變體抗菌活性均消失。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:人HMGB1酸性尾端中201-205氨基酸殘基對其抗菌功能的發(fā)揮至關(guān)重要。3.人工合成的人HMGB1酸性尾端抗菌活性研究 (1)人工合成30個(gè)氨基酸殘基組成的人HMGB1酸性尾端肽段。 (2)體外抗菌實(shí)驗(yàn)(試管稀釋法、瓊脂擴(kuò)散法)結(jié)果顯示:該肽段對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌JM109、ATCC25922、DH5α具有不同程度的抗菌活性,其中對DH5α抗菌活性最弱;而對綠膿桿菌則無此抗菌活性。因此,單獨(dú)的人HMGB1酸性尾端肽段即具有抗菌活性。 結(jié)論: 1.人HMGB1酸性尾端中201-205氨基酸殘基在抗菌活性的發(fā)揮中起至關(guān)重要的作用。 2.人工合成30個(gè)氨基酸殘基組成的人HMGB1酸性尾端肽段對部分細(xì)菌具有明確的抗菌活性,從另一側(cè)面證實(shí)HMGB1的酸性尾端對其抗菌功能的發(fā)揮至關(guān)重要。 第二部分HMGB1為靶點(diǎn)的抗炎措施研究 研究目的:HMGB1是一種具有寬治療窗口期的關(guān)鍵炎癥因子,在多種急、慢性炎癥疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起著極為重要的作用,目前以該分子為靶標(biāo)的抗炎措施越來越受到人們的關(guān)注�，F(xiàn)有研究證實(shí),其發(fā)揮致炎作用的主要功能域?yàn)锽 box。然而,體外表達(dá)的單獨(dú)A box能抑制HMGB1致炎活性,有明確的抗炎功能。同時(shí),酸性尾端具有調(diào)節(jié)A box、B box結(jié)構(gòu)和功能的作用。如果能將HMGB1具有抗炎功能的A box與具有抗菌功能的酸性尾端融合就有可能得到兼具抗炎、抗菌雙功能的衍生分子。又有研究顯示,被分泌至細(xì)胞外的HMGB1除是一種重要的炎癥細(xì)胞因子外,還參與激活機(jī)體自身免疫系統(tǒng),與多種自身免疫性疾病密切相關(guān)。中藥提純單體青藤堿(sinomenine,SIN)具有抗炎、免疫抑制等藥理作用,廣泛應(yīng)用于臨床治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、干燥綜合征(SS)等慢性炎性自身免疫性疾病,并取得較好療效。然而,SIN是否可影響HMGB1表達(dá)目前尚未見報(bào)道。本部分實(shí)驗(yàn)以HMGB1為靶點(diǎn),制備由HMGB1 A box及酸性尾端組成的兼具抗炎、抗菌雙功能的衍生分子;同時(shí)研究SIN對HMGB1表達(dá)的影響,并初步探討其可能機(jī)制。 方法及結(jié)果: 1.HMGB1 A box和酸性尾端融合分子的制備 (1)以克隆于pUC19載體中測序正確的、編碼人HMGB1的cDNA為模板,經(jīng)一步反向PCR,在缺失B box編碼序列的同時(shí),將A box與酸性尾端的編碼序列直接相連(此連接為剛性連接),命名為pUC19/rHMGB1 A+T。 (2)再用上述克隆于pUC19載體上測序正確的、處于剛性連接的A box與酸性尾端編碼序列為模板,經(jīng)多次一步反向PCR在A box與酸性尾端編碼序列之間引入一個(gè)柔性連接子(Gly4Ser)3的編碼序列(此連接為柔性連接),命名為pUC19/rHMGB1 A+Linker+T。 (3)將測序正確的A box與酸性尾端剛性、柔性連接融合分子編碼序列分別亞克隆于原核表達(dá)載體pQE-80L,分別命名為pQE-80L/rHMGB1 A+T、pQE-80L/rHMGB1 A+Linker+T,并在大腸桿菌DH5α中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)上述融合蛋白。SDS-PAGE分析可見,兩融合蛋白的相對分子質(zhì)量分別約為16kDa和18kDa。經(jīng)Ni2+-NTA純化系統(tǒng),兩融合蛋白得到有效純化,純化后的目的蛋白在SDS-PAGE上均呈現(xiàn)單一條帶。 2.HMGB1 A box和酸性尾端融合分子抗炎功能的鑒定與比較 (1)體外抗炎實(shí)驗(yàn)證實(shí),兩融合蛋白與單獨(dú)A box類似均能抑制重組HMGB1誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞THP-1分泌炎癥因子腫瘤壞死因子a(TNF-a)和白細(xì)胞介素6(IL-6),兩融合蛋白抑制炎癥因子作用均比單獨(dú)的A box強(qiáng),且柔性連接的融合蛋白抗炎能力是三者中最強(qiáng)的。 (2)在LPS誘導(dǎo)的小鼠內(nèi)毒素血癥模型(模擬內(nèi)毒素引起的系統(tǒng)性炎癥)中兩融合蛋白均能降低血清炎癥因子TNF-a、IL-6的濃度并能提高小鼠的存活率;同體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似柔性連接的融合蛋白降低血清中炎癥因子濃度及提高小鼠存活率作用更強(qiáng)。 3.HMGB1 A box和酸性尾端融合分子抗菌功能的檢測與比較 體外抗菌實(shí)驗(yàn)(試管稀釋法、瓊脂擴(kuò)散法)結(jié)果顯示,A box與酸性尾端剛性連接和柔性連接兩融合蛋白均能不同程度抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌(JM109、ATCC25922、DH5α)生長,但二者的抑制細(xì)菌生長能力并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;均對綠膿桿菌無抗菌活性。 4.鹽酸青藤堿抑制基礎(chǔ)水平和LPS誘導(dǎo)的HMGB1表達(dá) (1)在人內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926中鹽酸青藤堿可抑制基礎(chǔ)水平的HMGB1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá),且呈劑量依賴性。 (2)在人內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926中鹽酸青藤堿可抑制LPS誘導(dǎo)水平的HMGB1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá),且呈劑量依賴性。 5.鹽酸青藤堿抑制HMGB1基因啟動子活性 (1)成功克隆到具有活性的HMGB1基因5’上游啟動子區(qū)域(-2484~+200),并構(gòu)建長度不同的HMGB1基因啟動子區(qū)域截短突變體(-1998~+200、-1598~+200、-1198~+200、-798~+200、-397~+200)報(bào)告基因檢測質(zhì)粒。 (2)熒光素酶(Luc)報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果知,鹽酸青藤堿可抑制-2484~+200、-1998~+200、-1598~+200、-1198~+200報(bào)告基因質(zhì)粒啟動子活性,但對-798~+200、-397~+200報(bào)告基因質(zhì)粒啟動子活性無影響,此結(jié)果表明HMGB1基因5’上游啟動子區(qū)域-1198~-798序列在青藤堿抑制HMGB1轉(zhuǎn)錄中起至關(guān)重要的作用。 結(jié)論: 1.人HMGB1 A box與酸性尾端剛性連接和柔性連接兩種衍生分子均是兼具抗炎、抗菌的雙功能分子;酸性尾端可增強(qiáng)A box的抗炎活性,且柔性連接的融合分子抗炎活性強(qiáng)于剛性連接的融合分子,但其二者在抗菌活性方面無差異; 2.青藤堿可抑制基礎(chǔ)水平及LPS誘導(dǎo)的HMGB1表達(dá),且HMGB1基因5’上游啟動子區(qū)域-1198~-798序列與青藤堿抑制HMGB1轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R341

【引證文獻(xiàn)】

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1 朱難蘭;血栓調(diào)節(jié)蛋白N端結(jié)構(gòu)域抗炎作用的初步研究[D];華中科技大學(xué);2013年

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本文編號：2422993