【摘要】：研究背景： 神經(jīng)系統(tǒng)作為一個神奇而復雜的組織，無論在其解剖結(jié)構(gòu)還是生物學方面都存在精細的調(diào)控環(huán)節(jié)。2013年美國政府宣布投入1億美元用于大腦研究，試圖解決迄今無法解決的難題：為人類大腦行動路線做記錄并制圖，顯示“百萬大腦細胞是如何互動的”。其重要研究內(nèi)容就包括了：測量關(guān)于單個神經(jīng)細胞是如何工作的，信息在神經(jīng)細胞之間是如何傳遞的，以及當產(chǎn)生記憶時神經(jīng)細胞之間的聯(lián)系是如何得到加強和減弱的。而神經(jīng)導向因子能夠在神經(jīng)元發(fā)育和信息傳遞過程中發(fā)揮調(diào)控作用，能夠引導神經(jīng)細胞定向生長，為神經(jīng)系統(tǒng)復雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和特異的傳導功能提供解剖和生理基礎(chǔ)；因此，它成為大家研究的熱點問題。神經(jīng)導向因子netrin-1是最早發(fā)現(xiàn)的可溶性神經(jīng)導向因子，在許多物種的神經(jīng)系統(tǒng)中都有高表達。在神經(jīng)發(fā)育過程中，神經(jīng)生長因子netrin-1通過與結(jié)腸直腸癌缺失蛋白（deleted in colorectal cancer, DCC）和UNC-5同源蛋白(uncoordinated-5homolog, UNC5H)兩大受體家族結(jié)合發(fā)揮作用。其中，UNC5B（Uncoordinated-5homolog B receptor）與netrin-1結(jié)合在神經(jīng)細胞發(fā)育中發(fā)揮負向調(diào)控作用；這種作用與DCC受體參與的正向調(diào)控作用協(xié)調(diào)，共同促進生長錐生長使軸突延長，引導其生長方向。近些年的研究還表明，netrin-1和UNC5B在很多腫瘤中表達異常，可能在腫瘤的發(fā)生過程中扮演重要角色。為了進一步深入探討UNC5B在腫瘤中的表達及其相關(guān)功能，制備了UNC5B單克隆抗體。本研究選擇性的選取UNC5B基因胞外區(qū)的兩個免疫球蛋白區(qū)域（Ig domain）進行抗體制備。由于該區(qū)域能夠與配體netrin-1結(jié)合，通過激活下游信號發(fā)揮生物學功能。因此用該片段免疫小鼠制備的單克隆抗體，不僅能夠與UNC5B結(jié)合，還具有其他的生物學活性。 目的： 本研究旨在應用單克隆抗體技術(shù)，制備能夠識別UNC5B蛋白的單克隆抗體，用以探討UNC5B與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系。并在食管癌組織中探討了UNC5B的表達，為以后相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。 方法： （1）首先體外擴增UNC5B基因胞外端序列，將該序列插入帶有His標簽的原核表達載體pET-32a中進行原核表達。分析原核表達產(chǎn)物的可溶性，進行規(guī)�；磉_。 （2）利用GE Healthcare公司Glutathione Sepharose4B純化說明書，純化UNC5B重組蛋白；利用Nano drop測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳考馬斯亮藍染色分析蛋白純度。 （3）經(jīng)傳統(tǒng)單克隆抗體技術(shù)，制備UNC5B單克隆抗體；然后以商品化UNC5B多抗為對照，用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、蛋白印跡（Western Blot）、免疫熒光（Immunoflourescence）和流式細胞（Flow Cytometry）方法驗證單克隆抗體與UNC5B的特異性結(jié)合能力。 （4）細胞遷移能力分析：細胞劃痕實驗能夠模擬體外細胞致傷愈合的修復過程，根據(jù)培養(yǎng)基中添加UNC5B單克隆抗體及其配體netrin-1后細胞遷移長度的變化，分析該化合物對細胞損傷愈合的影響；transwell實驗模擬體內(nèi)細胞遷移的原理，根據(jù)上、下小室營養(yǎng)成分趨化細胞遷移數(shù)量的不同，分析其對細胞遷移的影響。 （5）細胞增殖實驗（CCK-8assay）檢測netrin-1和UNC5B單抗對腫瘤細胞增殖能力的影響。 （6）收集食管癌病人病理標本，免疫組化技術(shù)探討UNC5B在食管癌上的表達。 結(jié)果： 原核表達了帶His標簽的UNC5B融合蛋白，5000r/min收集細菌，超聲破碎，SDS-PAGE電泳分析，在裂解后上清中有一50kDa的蛋白，與預期大小一致。說明蛋白主要為分泌型。所以大量誘導細菌，經(jīng)Glutathione Sepharose4B純化蛋白，SDS-PAGE電泳分析，該純度能夠用于免疫小鼠。利用傳統(tǒng)的單克隆抗體技術(shù)，經(jīng)間接ELISA成功篩選出一株抗體2C9，抗體效價較高為1:32,000。然后用ELISA、WesternBlot、Immunoflourescence和Flow Cytometry方法驗證單克隆抗體能夠識別轉(zhuǎn)染后的UNC5B和天然UNC5B蛋白，該抗體具有免疫結(jié)合的特異性。 另外，我們利用2C9檢測到黑色素瘤細胞A375細胞表面有UNC5B表達。利用細胞劃痕和transwell實驗檢測了2C9對A375細胞遷移的影響。實驗結(jié)果說明，netrin-1能夠抑制黑色素瘤細胞A375的遷移，與空白對照組存在顯著性差異（P0.01）；另外，2C9能夠逆轉(zhuǎn)netrin-1對細胞遷移的抑制作用，與netrin-1對照組存在顯著性差異（P0.01）。并且，此處理條件對細胞增殖無影響（P0.05）。 最后，根據(jù)病理資料和標本完整性，選取三個食管癌病人。免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食管癌組織中有UNC5B表達，，且高于正常組織。 結(jié)論： （1）利用pET-32a原核表達載體，成功表達了UNC5B胞外端的融合蛋白； （2）利用雜交瘤技術(shù)成功制備了一株效價高、特異性好的UNC5B單克隆抗體2C9。該抗體具有抗原識別特異性，能用Western Blot、免疫熒光和流式細胞技術(shù)檢測UNC5B表達情況。同時發(fā)現(xiàn)黑色素瘤細胞A375細胞表面有UNC5B表達。 （3）細胞劃痕（wound healing）和transwell實驗均證明，netrin-1能抑制A375細胞的遷移；但同時加入2C9后，不但不能抑制遷移，與加netrin-1實驗組相比，反而促進了細胞遷移。CCK-8檢測細胞增殖能力，結(jié)果該實驗條件對細胞增殖亦沒有影響。為此我們推測，可能是細胞表面netirn-1不同受體的競爭結(jié)合作用。該研究結(jié)果為下一步探討netrin-1、UNC5B參與腫瘤細胞遷移的相關(guān)機制奠定基礎(chǔ)。 （4）免疫組化分析人食管癌組織中UNC5B存在高表達，為進一步研究UNC5B表達與臨床指標的相關(guān)性提供基礎(chǔ)。
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【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉新光,梁念慈,馬澗泉;重組人CK2β亞基的原核表達、純化與鑒定[J];生物化學與生物物理進展;2000年02期

本文編號：2415502