【摘要】： 背景與目的 炎癥是人類多種疾病中一種最常見的病理過程,可發(fā)生于機體的任何部位和組織,是機體對感染或創(chuàng)傷等引起的內環(huán)境紊亂的正常反應。但是過度的炎癥反應會引發(fā)全身炎癥反應綜合癥,導致機體組織細胞自身性損害,表現(xiàn)為膿毒癥,膿毒性休克甚至多器官功能障礙綜合征。臨床上革蘭氏陰性菌感染引起的炎癥反應損傷是一種常見疾病,往往難于控制,嚴重時可引起內毒素血癥或感染性休克,危及病人生命。革蘭氏陰性菌細胞外膜的活性成分內毒素即脂多糖(LPS)是引發(fā)急性炎癥反應的關鍵致病物質,它能激活機體單核吞噬細胞系統(tǒng),產生一系列炎性介質,導致疾病的發(fā)生和發(fā)展。新近發(fā)現(xiàn)并廣為研究的Toll樣受體2(TLR2)與LPS引起的免疫反應及其導致的機體損傷有很大的關系,TLR2識別的配體最多,參與人體內對LPS的反應,介導炎癥信號傳入胞內激發(fā)一系列炎癥反應,在識別各種病原微生物引發(fā)機體的固有免疫應答反應中扮演重要的角色�，F(xiàn)已證實多種致炎細菌成分都直接或間接激活TLR2繼而使白細胞活化,白細胞活化后,一方面殺滅細菌,另一方面又釋放多種致炎介質和細胞因子導致炎癥反應,劇烈過度的全身性炎癥反應則可影響多個臟器并最終導致不可逆的病理損傷。因此,阻斷或抑制TLR2的激活,則有可能抑制白細胞的活化,阻斷白細胞炎性介質的合成與分泌,避免多種細菌成分導致的嚴重炎癥反應的發(fā)生。由于可溶性TLR2胞外區(qū)蛋白(sTLR2)具有和白細胞膜上天然的TLR2受體胞外區(qū)相同的與細菌成分相結合的能力,理論上sTLR2可以通過競爭性抑制白細胞膜上相應受體的激活,從而阻止白細胞活化和釋放炎性介質進而達到抗炎治療的目的�；诖�,本實驗采用腺病毒表達策略,首先克隆人TLR2胞外區(qū)基因,然后制備攜帶TLR2胞外區(qū)基因的重組腺病毒載體,獲得可以表達sTLR2的高滴度純化病毒,觀察重組腺病毒介導sTLR2在動物模型體內的抗炎作用,以探明sTLR2的抗炎機制,為急性炎癥反應的防治提供新的思路和治療策略。 研究方法 1.分離健康人外周血單個核細胞,提取其RNA作為模板采用RT-PCR方法擴增人TLR2胞外區(qū)cDNA。目的基因經純化后將其亞克隆至pUCm-T載體上構建重組質粒pUCm-TLR2,選取鑒定正確的克隆測序,并將測序結果與GenBank中人TLR2胞外區(qū)基因序列進行同源性比較分析。 2.將測序正確的TLR2胞外區(qū)目的片段定向克隆至腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV上構建重組質粒pAdTrack-CMV-TLR2,將陽性重組子酶切線性化后轉化感受態(tài)AdEasier-1細菌,在E.coli BJ5183內與腺病毒骨架質粒pAdEasy-1進行細菌內同源重組獲得重組腺病毒質粒pAd-TLR2。 3.將鑒定正確的重組質粒pAd-TLR2以脂質體法轉染293細胞中進行包裝并且擴增病毒。觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達,純化并測定病毒滴度,以PCR方法鑒定重組腺病毒并進行野生型病毒檢測分析其應用的安全性。 4.建立致死劑量LPS所致炎癥動物模型;40只BALB/c小鼠隨機分為A和B兩個實驗組,重組腺病毒AdTLR2于致炎之前(A實驗組)和致炎之后(B實驗組)分別作用于炎癥小鼠,觀察其對小鼠生存時間的影響。 5.建立小劑量LPS所致炎癥動物模型;40只BALB/c小鼠隨機分為四組:正常對照組(尾靜脈注射0.9%生理鹽水)、炎癥對照組(腹腔緩慢注射小劑量LPS溶液)、重組腺病毒AdTLR2 A組(LPS致炎之前尾靜脈注射病毒懸液)、重組腺病毒AdTLR2 B組(LPS致炎之后尾靜脈注射病毒懸液)。觀察48h后,摘眼球取血,分離血清,應用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)對血清中細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量變化進行檢測,探討AdTLR2對小鼠血清細胞因子水平變化的影響。 結果 1.從健康人外周血單個核細胞中應用RT-PCR技術成功擴增TLR2胞外區(qū)cDNA,并且成功構建重組質粒pUCm-TLR2。 2.經測序及序列同源性比較,本實驗所克隆的目的片段長度為1764bp,測序結果無堿基突變與GenBank中人TLR2胞外區(qū)基因序列完全吻合。 3.經雙酶切及DNA測序鑒定,證實插入序列和讀碼框架正確,重組腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV-TLR2構建成功。 4.重組腺病毒穿梭質粒與骨架質粒通過在E.coli BJ5183內的同源重組獲得重組腺病毒質粒pAd-TLR2,經PacⅠ酶切后可見一條約30kb大小的條帶和一條4.5kb的特征性條帶,表明同源重組成功。 5.將線性化的重組腺病毒質粒pAd-TLR2轉染293細胞后,在熒光顯微鏡下可以觀察到明亮的綠色熒光,并且出現(xiàn)典型的細胞病變效應(cytopathic effect, CPE),說明重組腺病毒包裝成功。 6.擴增后收集病毒,經氯化銫密度梯度離心純化獲得3×109 PFU/mL的高滴度重組腺病毒AdTLR2,以PCR鑒定其攜帶有所克隆入的TLR2胞外區(qū)目的基因,并且經檢測無野生型病毒存在。 7. BALB/c小鼠經腹腔注射LPS后成功復制內毒素血癥炎癥動物模型,制備的重組腺病毒AdTLR2對小鼠無明顯的毒性作用,實驗動物對病毒耐受良好。 8.重組腺病毒AdTLR2作用于致死劑量LPS所致炎癥動物模型后,A實驗組和B實驗組小鼠的生存時間與炎癥對照組比較相對延長。 9.重組腺病毒AdTLR2作用于小劑量LPS所致炎癥動物模型后,AdTLR2 A組和AdTLR2 B組中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的血清水平均較炎癥對照組有所降低,差異顯著具有統(tǒng)計學意義(P0.05),AdTLR2 A組與AdTLR2 B組數(shù)據(jù)之間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結論 1.成功克隆TLR2胞外區(qū)基因cDNA全部編碼序列,經測序及序列同源性比較,證實目的基因無堿基突變與GenBank中所提供的相關序列完全吻合。 2.應用AdEasy System腺病毒表達系統(tǒng)成功構建攜帶有TLR2胞外區(qū)基因的重組腺病毒載體AdTLR2,經293細胞擴增、純化后獲得3×109 PFU/mL的高滴度重組腺病毒,此在國內外尚未見報道。 3.制備的重組腺病毒AdTLR2能夠使LPS所致炎癥小鼠模型的生存時間相對延長,并且能夠降低炎癥小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量,提示AdTLR2在活體內可以分泌sTLR2蛋白并且發(fā)揮免疫調節(jié)的作用,能夠抑制血清中炎性細胞因子的表達水平,具有一定的抗炎作用。
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【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R363

【參考文獻】

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本文編號：2415201