【摘要】： 實驗背景 骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone Marrow Stem Cells, BMSCs)作為目前較理想的組織工程瓣膜間質(zhì)細胞的種子細胞,相對于其他來源的種子細胞具有獲取方便、很強的自我更新、多向分化潛能,以及獨特的免疫特性等優(yōu)點。正常心臟瓣膜間質(zhì)細胞中的成纖維細胞對于維持正常心臟瓣膜的結(jié)構(gòu)和功能具有更重要的意義。目前應(yīng)用hBMSCs構(gòu)建的組織工程心臟瓣膜多需移植入動物體內(nèi)后一段時間才能完成組織工程瓣膜的成纖維細胞表型和基質(zhì)的最后重塑,尚不清楚hBMSCs向成纖維細胞進行分化的具體機制以及其功能特點。 BMSCs和成纖維細胞具有非常相似細胞形態(tài)、細胞表型特點及細胞表面分子。通過基因組學(xué)的方法研究發(fā)現(xiàn)在兩種細胞中確實存在一些差異基因。蛋白質(zhì)組,作為細胞基因組的最后表達,能夠更詳盡、更直接地描述細胞的結(jié)構(gòu)和功能特點。 目的采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法全面比較hBMSCs和成纖維細胞中蛋白表達的差異,進一步在蛋白水平理解兩種在細胞結(jié)構(gòu)和功能差異。 方法 1.自正常人髂骨抽取骨髓,綜合采用密度梯度離心和貼壁篩選的方法,分離、純化出hBMSCs,在低糖DMEM/F12培養(yǎng)、擴增;倒置顯微鏡觀察細胞生長,流式細胞儀檢測表面抗原CD29、CD34和CD45,并對骨髓間充質(zhì)干細胞進行成骨、成脂多向分化誘導(dǎo),進行細胞性質(zhì)鑒定。成纖維細胞是人成纖維細胞系細胞(購自Cell Applications公司)。 2.對兩種細胞的蛋白樣本進行雙向凝膠電泳分離,通過銀染顯色,獲取兩種細胞的蛋白組學(xué)圖譜,通過比較兩種細胞的圖譜,挖取差異表達的蛋白點進行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜肽質(zhì)量指紋圖分析和蛋白數(shù)據(jù)庫信息檢索。選取蛋白進行Western Blot和免疫組織化學(xué)實驗驗證蛋白質(zhì)組學(xué)的研究結(jié)果。 結(jié)果 1.原代細胞呈貼壁,集落樣生長;細胞傳代后,呈梭形,少數(shù)細胞呈多角形,魚群或放射狀排列。hBMSCs的表面抗原CD29陽性而造血干細胞具有的表面抗原CD34和CD45為陰性;成骨和成脂誘導(dǎo)后,分別行Von kossa染色和油紅-O染色結(jié)果呈陽性。實驗從正反兩方面論證、確認了所分離培養(yǎng)的細胞即為hBMSCs。 2.hBMSCs和成纖維細胞全蛋白提取后,進行雙向凝膠電泳分析,共進行3次實驗得到銀染結(jié)果,兩種細胞的電泳圖譜蛋白斑點分布模式具有一定的相似性。3次重復(fù)性實驗結(jié)果經(jīng)ImagingMaster 2D Elite 510軟件分析,發(fā)現(xiàn)hBMSCs可以檢測到782±65個點,成纖維細胞可以檢測到760±57個點,這些蛋白質(zhì)等電點和相對分子質(zhì)量分布范圍較廣,但大多數(shù)集中于pH 4～8,相對分子質(zhì)量15～100 ku區(qū)域。對其中穩(wěn)定表達的差異蛋白質(zhì)斑點進行切割,用胰蛋白酶消化后進行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜分析,通過UniProtKB/Swiss-PROT和NCBI nonredundant protein databases蛋白數(shù)據(jù)庫搜索,成功地鑒定出29種表達蛋白,其中有17種蛋白在兩種細胞中有顯著差別地表達,另外12種蛋白在兩種細胞中有相同豐度地表達。Western Blot的實驗和免疫組織化學(xué)實驗結(jié)果進一步驗證了蛋白質(zhì)組學(xué)的分析結(jié)果。 結(jié)論 實驗首次對hBMSCs和成纖維細胞進行蛋白質(zhì)組學(xué)研究,成功發(fā)現(xiàn)了兩種細胞的差異表達蛋白,這些蛋白體現(xiàn)了兩種細胞在細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上的異同性。這對于研究hBMSCs向成纖維細胞分化以及應(yīng)用hBMSCs構(gòu)建組織工程瓣膜具有重要意義。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R329

【引證文獻】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 聞重秋;脂肪源干細胞移植治療骨質(zhì)疏松及其成骨分化蛋白質(zhì)譜構(gòu)建[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

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本文編號：2407741