【摘要】： 目的: 構(gòu)建重組瘦素基因(Leptin)真核表達(dá)質(zhì)粒pTracerTM-Leptin;轉(zhuǎn)染SD大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(marrow stromal cell, MSCs),研究Leptin基因?qū)SCs增殖分化的影響。 方法: 提取人脂肪組織總RNA,根據(jù)GeneBank公布的Leptin基因序列設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物,采用RT-PCR技術(shù)克隆Leptin基因,酶切后重組到帶有GFP標(biāo)記的pTracerTM-CMV/Bsd載體上,構(gòu)建重組基因真核質(zhì)粒pTracerTM-Leptin。采用密度梯度離心法體外獲得SD大鼠的骨髓基質(zhì)細(xì)胞,將重組真核質(zhì)粒pTracerTM-Leptin通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞,以抗生素Blasticidin加壓篩選獲得Leptin基因修飾的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株,普通光鏡及熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)基因細(xì)胞形態(tài),采用分子生物學(xué)法(RT-PCR法)和免疫學(xué)法(Western blot法)分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)目的基因在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯,MTT法檢測(cè)Leptin基因?qū)SCs的生長(zhǎng)增殖情況,ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞上清骨鈣素(OC)分泌水平,并采用對(duì)硝基苯磷酸鹽(PNP)試劑盒測(cè)定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活力,半定量RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因Cbfα1和Cbfβ的表達(dá)。 結(jié)果: 成功獲得約450bp的人Leptin基因,PCR、雙酶切及序列測(cè)定結(jié)果顯示成功構(gòu)建了重組基因真核質(zhì)粒pTracerTM-Leptin,并轉(zhuǎn)染密度梯度分離法獲得的大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞,加壓篩選后獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞,熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光,并伴有細(xì)胞形態(tài)變化,實(shí)驗(yàn)組的RT-PCR和Western blot結(jié)果均出現(xiàn)目的條帶,表明脂質(zhì)體介導(dǎo)的Leptin基因可以在骨髓基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá),且促進(jìn)MSCs增殖,并有一定的時(shí)間依賴性,轉(zhuǎn)基因細(xì)胞上清中OC含量增加,ALP活力上調(diào),成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Cbfα1和CbfβmRNA表達(dá)量也增高。 結(jié)論: 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了重組真核質(zhì)粒pTracerTM-Leptin,轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞后,Leptin基因可以使其增殖,且促進(jìn)成骨樣改變。
[Abstract]:Aim: to construct recombinant (Leptin) eukaryotic expression plasmid of leptin gene (Leptin) and transfect (marrow stromal cell, MSCs), into SD rat bone marrow stromal cells to study the effect of Leptin gene on MSCs proliferation and differentiation. Methods: a pair of primers were designed and synthesized from human adipose tissue total RNA, according to the Leptin gene sequence published by GeneBank. The Leptin gene was cloned by RT-PCR technique. The Leptin gene was digested and recombined into pTracerTM-CMV/Bsd vector marked with GFP. Construction of Recombinant Eukaryotic plasmid pTracerTM-Leptin. Bone marrow stromal cells of SD rats were obtained by density gradient centrifugation in vitro. The recombinant eukaryotic plasmid pTracerTM-Leptin was transfected into bone marrow stromal cells by liposome transfection. Leptin gene modified transgenic cells were obtained by Blasticidin pressurized screening. The morphology of transgenic cells was observed under light microscope and fluorescence microscope. The transcription and translation of target genes in transgenic cells were detected by molecular biology (RT-PCR) and immunological (Western blot (Western blot) from the level of mRNA and protein, respectively. MTT assay was used to detect the growth and proliferation of Leptin gene to MSCs, ELISA method was used to detect the level of osteocalcin (OC) secretion in the supernatant of transgenic cells, and the activity of alkaline phosphatase (ALP) (ALP) in transgenic cells was determined by using p-nitrophenyl phosphate (PNP) kit. The expression of osteoblast differentiation related genes Cbf 偽 1 and Cbf 尾 in transgenic cells was detected by semi quantitative RT-PCR. Results: the human Leptin gene of about 450bp was successfully obtained. The results of PCR, double enzyme digestion and sequencing showed that the recombinant gene eukaryotic plasmid pTracerTM-Leptin, was successfully constructed and transfected into rat bone marrow stromal cells obtained by density gradient separation. After pressurized screening, the transgenic cells were obtained. Green fluorescence was observed under fluorescence microscope, accompanied by cell morphological changes. The results of RT-PCR and Western blot in the experimental group showed the target bands. The results indicated that Leptin gene mediated by liposome could be expressed in bone marrow stromal cells and promoted the proliferation of MSCs in a time-dependent manner. The content of OC in the supernatant of transgenic cells was increased and the activity of ALP was upregulated. The expression of Cbf 偽 1 and Cbf 尾 mRNA in osteoblasts was also increased. Conclusion: after transfection of recombinant eukaryotic plasmid pTracerTM-Leptin, into bone marrow stromal cells, Leptin gene can proliferate and promote osteoblast-like changes.
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2406097