【摘要】： 蛋白質(zhì)酪氨酸硝化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基一旦發(fā)生翻譯后修飾,就會對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生重要的影響,進(jìn)而與多種疾病的發(fā)生發(fā)展緊密聯(lián)系。在病理條件下,蛋白質(zhì)容易受到各種活性氧和活性氮自由基的損傷,發(fā)生蛋白質(zhì)酪氨酸硝化。蛋白質(zhì)酪氨酸硝化常常伴隨有蛋白質(zhì)氧化,使得對蛋白質(zhì)酪氨酸硝化功能的研究變得復(fù)雜。此外,在蛋白質(zhì)硝化和氧化的過程中,生物體內(nèi)廣泛存在的微量元素鐵起著非常重要的催化作用。到目前為止,蛋白質(zhì)硝化和氧化修飾與鐵的關(guān)系,及其對蛋白質(zhì)功能的不同影響尚未完全明了。本文從體外化學(xué)體系和動物模型兩個方面入手,首先以烯醇酶為研究對象,在體外化學(xué)體系中研究了由鐵誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)硝化和氧化修飾對烯醇酶功能的影響；并在此基礎(chǔ)上考察了抗氧化劑去鐵胺(DFO)對蛋白質(zhì)硝化和氧化損傷的干預(yù)作用；最后,在動物模型上研究了糖尿病大鼠組織中烯醇酶硝化和氧化的情況,探討了生物體內(nèi)的硝化和氧化修飾對烯醇酶功能的影響。主要研究內(nèi)容包括以下幾個方面： (1)鐵在烯醇酶硝化和氧化修飾中的作用 選取酵母烯醇酶為研究對象,研究了不同形態(tài)鐵催化NO2--H2O2和ONOO-對烯醇酶硝化、氧化及酶活的影響。實驗結(jié)果顯示,在催化NO2--H2O2和ONOO"導(dǎo)致的烯醇酶硝化／氧化損傷中,實驗濃度(10μmol/L)下的檸檬酸鐵(Citrate-Fe)和鐵蛋白(ferritin)對兩種損傷體系沒有顯著影響,而乙二胺四乙酸鐵(EDTA-Fe)能促進(jìn)ONOO-導(dǎo)致的烯醇酶硝化,但對NO2--H2O2體系導(dǎo)致的蛋白質(zhì)硝化和氧化無顯著作用。氯高鐵血紅素(hemin)和血紅蛋白(hemoglobin)不僅能有效催化NO2--H2O2硝化和氧化蛋白質(zhì),同時它們也能有效促進(jìn)ONOO-導(dǎo)致的蛋白質(zhì)酪氨酸硝化,但對ONOO-導(dǎo)致的蛋白質(zhì)氧化有顯著的抑制作用。游離的二價鐵(Fe2+)和三價鐵(Fe3+)能有效促進(jìn)NO2--H2O2導(dǎo)致的烯醇酶氧化,但同時顯著地抑制ONOO-導(dǎo)致的烯醇酶硝化。此外,與蛋白質(zhì)硝化相比,烯醇酶活性與蛋白質(zhì)羰基化關(guān)系更密切,蛋白質(zhì)氧化程度越強,酶活力下降越明顯。在hemin-NO2--H2O2導(dǎo)致的烯醇酶硝化／氧化損傷中,蛋白質(zhì)氧化(非巰基氧化)對酶活的影響要顯著強于蛋白質(zhì)酪氨酸硝化,但酪氨酸修飾對酶活也有一定的影響。這些結(jié)果表明,不同硝化途徑導(dǎo)致的烯醇酶硝化／氧化修飾受鐵的影響不同,除儲存態(tài)鐵如ferritin外,其他形態(tài)的鐵都可能通過促進(jìn)氧化或硝化影響烯醇酶的功能。 (2)去鐵胺對蛋白質(zhì)硝化和氧化修飾的干預(yù)作用 研究了鐵螯合劑DFO對hemin-NO2--H2O2體系中蛋白質(zhì)硝化和氧化的影響,并對其作用機理進(jìn)行初步探討。在hemin-NO2--H2O2體系中,這種抗氧化劑在低濃度(0.01-0.1mmol/L)時對蛋白質(zhì)(牛血清白蛋白、谷氨酸脫氫酶、人血漿蛋白)的硝化和氧化有完全不同的作用,它能有效抑制蛋白質(zhì)硝化,而對蛋白質(zhì)的羰基化卻有促進(jìn)作用。在高濃度時,DFO則會發(fā)揮其抗氧化作用,抑制蛋白質(zhì)的硝化和氧化。進(jìn)一步研究證實,這種促氧化作用與heme-DFO復(fù)合物的形成密切相關(guān)。以上結(jié)果首次闡明了低濃度的DFO對heme-NO2--H2O2體系導(dǎo)致的蛋白質(zhì)硝化和氧化有完全不同的干預(yù)作用,研究結(jié)果對于深入認(rèn)識DFO在臨床和醫(yī)藥上的毒副作用有重要的生理意義。 (3)Hemin-DFO復(fù)合物促氧化機理的初步研究 從自由基產(chǎn)生的角度初步研究了hemin-DFO復(fù)合物的促氧化機制。實驗結(jié)果表明,在DFO促進(jìn)hemin-H2O2體系導(dǎo)致的氧化損傷中,DFO促氧化作用的發(fā)揮需要與hemin和H2O2共存,其促氧化機理可能是促進(jìn)了O2·-的生成。DFO完善的促氧化機制,有待進(jìn)一步研究。 (4)糖尿病大鼠組織中α-烯醇酶的硝化和氧化修飾 通過腹腔注射鏈脲霉素建立糖尿病大鼠模型,同時選取α-烯醇酶作為靶蛋白,利用免疫沉淀和Western blotting技術(shù)檢測糖尿病組織中α-烯醇酶的硝化和氧化,并采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定糖尿病大鼠心肌中α-烯醇酶的硝化位點,初步探討生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)酪氨酸硝化和氧化對α-烯醇酶功能的影響。實驗結(jié)果顯示,糖尿病大鼠心肌組織中蛋白質(zhì)硝化水平明顯提高,而其羰基化水平無顯著變化,同時,糖尿病肝臟和血清中蛋白質(zhì)硝化和羰基化水平均顯著性提高。通過免疫沉淀的方法,確證了糖尿病組織和血清中α-烯醇酶是一種易于發(fā)生酪氨酸硝化的蛋白質(zhì)。與正常大鼠相比,糖尿病心肌、肝臟和血清中α-烯醇酶的表達(dá)和硝化水平顯著上升,同時其氧化水平和酶活略微提高,但無統(tǒng)計學(xué)上的差異。此外,還通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),鑒定了糖尿病大鼠心肌中α-烯醇酶的硝化位點在Tyr257和Tyr131。而在體外ONOO-體系中,兒茶素選擇性地抑制烯醇酶的硝化(Tyr259和Tyr191),并部分恢復(fù)酶活。這些結(jié)果表明,相比于蛋白質(zhì)氧化,糖尿病組織中α-烯醇酶的硝化是一種更敏感的氧化損傷。盡管蛋白質(zhì)的羰基化對酶活的影響要強于蛋白質(zhì)硝化,但酪氨酸殘基的硝化修飾對烯醇酶失活也有一定的貢獻(xiàn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R341

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