【摘要】：脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)為革蘭氏陰性細菌細胞壁外膜的主要成分,具有一定的免疫活性。南極嗜冷細菌對極地海域極端環(huán)境的長期適應,已經具備了獨特的生理生化特性,近幾年國內外研究表明,極地細菌的組分成分及其代謝產物均具有較好的免疫活性。本實驗室從南極海洋中分離得到一株典型的嗜冷菌,經過鑒定命名為南極寡營養(yǎng)細菌AT82 (Alteromonas stellipolaris, AT82),簡稱AT82。前期的研究發(fā)現(xiàn),AT82脂多糖免疫注射黑鯛和大黃魚后,能顯著提高它們的白細胞吞噬活性、血清的抗菌活力和酚氧化酶活力,顯示出AT82 LPS對水產動物具有一定的安全性和免疫增強活性。本試驗將在此基礎上,研究AT82 LPS對三疣梭子蟹非特異性免疫的影響,期望為海洋經濟蟹類病害的生物防治和免疫增強劑的篩選提供參考,也為南極寡營養(yǎng)細菌生物活性物質制劑的開發(fā)提供依據(jù)。 1 AT82液體培養(yǎng)條件優(yōu)化及其脂多糖提取方法的改良 以Zobell 2216E為基礎培養(yǎng)基,通過對起始pH值,培養(yǎng)溫度,搖床轉速和接種量的研究,以菌體生長量和脂多糖提取液中多糖含量為評價指標,得到AT82液體培養(yǎng)的最佳條件：起始pH 7.5,培養(yǎng)溫度8℃,搖床轉速150r/min,接種量5%,裝液量200mL／500mL三角瓶,培養(yǎng)時間5d,此條件下得到的菌體干重為0.064g。 在AT82脂多糖的提取方面,以傳統(tǒng)的酚水法為基礎,在AT82菌懸液中增加溶菌酶(含50μg/mL)溫育1h,超聲波破碎30min, DNA酶和RNA酶(含50μg/mL)溫育1h后,脂多糖的得率從2.42%提高到6.73%,即從10g干菌體中可獲得0.673g粗脂多糖干粉。 2 AT82粗脂多糖及其滅活疫苗對三疣梭子蟹非特異性免疫的影響 本試驗研究了通過體腔注射AT82粗LPS及其滅活菌體疫苗后,分別在第3、6、9、12d時對三疣梭子蟹抽血。通過分析免疫后不同處理組梭子蟹血清的抗菌活力、溶菌酶、酚氧化酶、過氧化物酶、SOD酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力以及血細胞吞噬活力的變化,以研究它們對梭子蟹非特異性免疫功能的影響。結果表明,與對照組和生理鹽水組相比,滅活疫苗注射組(菌懸液濃度5×108cells/mL),低劑量LPS注射組(2mg/kg蟹體重)和高劑量LPS注射組(4mg/kg蟹體重)在第6、9d時可以顯著提高血清中溶菌酶、酚氧化酶、過氧化物酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力以及抗菌活力,在第9、12d時可以顯著提高血清中SOD酶活力,第3、6d時可以顯著提高血細胞的吞噬活力(p0.05)。而且低劑量的LPS對抗菌活力,溶菌酶,酚氧化酶,酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力以及血細胞吞噬活力的增強效果要優(yōu)于高劑量的LPS和滅活疫苗,表明低劑量LPS的免疫增強效果可能會更好。 3 AT82粗脂多糖的分離純化 采用Cellulose DEAE-52柱層析法對AT82粗脂多糖進了分離,采用SephadexG-100凝膠柱層析法對分離組分進一步的純化。結果表明,AT82粗脂多糖上Cellulose DEAE-52層析柱,得到2個主要組分LPS1和LPS2,得率分別為29.38%和16.97%。取LPS1和LPS2經Sephadex G-100凝膠柱層析后,分別得到純組分LPS1a和LPS2a,得率分別為41.62%和26.31%。 4純組分LPSla和LPS2a的結構分析 采用氣相色譜、凝膠滲透色譜、傅里葉變換紅外光譜等手段對LPS各純化組分的單糖組成、相對分子質量及主要特征基團等進行了研究。結果表明,LPSla由鼠李糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖組成,分別占總糖的相對百分含量為33.69、21.13、0.54和34.85%。LPS2a由鼠李糖、木糖、山梨糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖組成,分別占總糖的相對百分含量為24.88、0.92、4.55、13.98、12.07和24.43%。紅外圖譜表明,兩者均存在呋喃糖環(huán)和β-糖苷鍵。凝膠滲透色譜分析表明,LPS1a為相對均一的多糖,相對分子質量1.44×106,LPS2a為非均一多糖,其主要組分的相對分子質量1.75×106。 5 AT82粗LPS及其純化組分的抗氧化活性和體外對小鼠免疫功能的影響 AT82粗脂多糖及其純化組分均能有效地清除DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基,可有效抑制試驗小鼠肝組織和肝線粒體脂質過氧化過程中丙二醛的產生,它們不僅能單獨刺激小鼠脾淋巴細胞的轉化,而且與ConA具有協(xié)同作用,并隨著劑量的不同呈現(xiàn)雙向性變化。研究還發(fā)現(xiàn),LPS1比LPS2有更好的抗氧化活性和免疫調節(jié)作用,這可能與LPS1的分子量較小,含有O-糖苷鍵、三螺旋結構及較多的甘露糖和葡萄糖有關。
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【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R378

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本文編號：2393217