【摘要】： 炎癥反應,包括急性炎癥和慢性炎癥的一個重要特征是白細胞在局部炎癥區(qū)域的過度聚集。幾乎任何改變細胞穩(wěn)定因素的刺激,都能誘導趨化因子的分泌,從而募集特定的白細胞到達炎癥區(qū)域,過度積聚的白細胞也會促進產(chǎn)生過量的細胞因子,加劇細胞毒性反應,引發(fā)炎癥。在炎癥前期,病毒感染刺激因子激活體內(nèi)炎癥效應細胞,產(chǎn)生大量趨化因子并引起炎性細胞的大量積聚,趨化因子高水平的持續(xù)不適當?shù)谋磉_,也會使募集的白細胞大量增加形成破壞性的損傷,導致自身免疫病的發(fā)生。同時,白細胞介導的損傷又使趨化因子高水平表達或使其他類型的趨化因子表達增加,產(chǎn)生進一步的組織損傷,這樣使白細胞對機體的保護作用被破壞而引起疾病。因而,針對趨化因子及其受體的抑制劑、拮抗劑有可能成為炎癥反應治療的新的靶點。 本課題擬運用噬菌體展示技術從噬菌體肽庫中篩選與炎癥前期產(chǎn)生的相關趨化因子結合并可特異性阻斷趨化因子進一步致炎作用的噬菌體克隆,近年來,隨著噬菌體展示技術應用范圍的不斷擴大和研究的不斷深入,它在炎癥反應的研究中發(fā)揮的作用也越來越大。以炎癥反應產(chǎn)生的趨化因子為靶標,篩選得到與趨化因子具有高親和力的短肽,可以抑制炎癥感染前期產(chǎn)生的趨化因子,從而阻斷機體的炎癥反應,并且能克服常規(guī)大分子藥物的分子量大、組織滲透性弱、不穩(wěn)定、有免疫原性及體內(nèi)運輸能力差的等缺點,為炎癥反應藥物的開發(fā)研究提供了新的方法。篩選得到的陽性克隆經(jīng)DNA序列測定、多肽的分析比較研究,確定其活性,再研究其對炎癥反應的抑制作用原理,為新型抗炎因子作用靶點的發(fā)掘奠定基礎。 篩選出的拮抗劑先導物對感染產(chǎn)生的細胞因子有抑制作用,從而阻斷機體的炎癥反應,而且一系列的藥效和毒理學實驗都表明,廣譜趨化因子功能抑制劑不僅具有強大抗炎效果,而且相較于甾體類抗炎藥物有明顯的降低毒副反應的作用,因此具有極其優(yōu)秀的開發(fā)應用前景。 目的： 通過篩選出炎癥前期趨化因子的抑制劑先導物,對感染產(chǎn)生的炎癥相關趨化因子產(chǎn)生拮抗作用,從而阻斷機體的炎癥反應,為炎癥感染的防治探索新途徑。 研究方法： 1.常規(guī)方法抽提和培養(yǎng)外周血單核細胞(PBMC),以的脂多糖(LPS)刺激PBMC建立體外急性炎癥模型,濃縮收集并分析上清液中趨化因子的產(chǎn)生情況。 2.利用噬菌體隨機十二肽庫進行親和篩選,獲得噬菌體陽性克隆。 3.將獲得的陽性噬菌體克隆進行DNA測序,應用多種生物信息學軟件將多肽序列進行比較分析,推導與炎性相關趨化因子廣譜結合的的小分子十二肽。 4.通過趨化抑制試驗選擇抑制率高的克隆進行合成并研究其活性； 5.對合成的短肽進行MTT檢測和體外活性檢測,研究其對炎性趨化因子的抑制情況； 6.利用鈣流試驗檢測短肽是否與趨化因子受體有關； 7.根據(jù)廣譜趨化因子抑制劑的分子作用機制,采用RT-PCR試驗檢測其mRNA水平的趨化因子表達情況,以研究短肽降低趨化因子表達的作用機制。 實驗結果： 1.經(jīng)過4輪噬菌體親和篩選,噬菌體克隆回收率從5.51×10-8增加到5.06×10-6,第四輪的回收率約是第一輪91.83倍,說明目標噬菌體克隆得到了有效富集。 2.效價測定實驗發(fā)現(xiàn)有16個克隆效價較高,瓊脂糖凝膠試驗發(fā)現(xiàn)其中10個克隆的DNA處于相同的位置,條帶比較清晰,對其進行測序。 3.測序結果發(fā)現(xiàn)有5個克隆有相同的插入序列高概率短肽,命名為P1肽,另外5個同源性較差,利用PROTPARAM生物信息學軟件分析各條短肽的理化性質(zhì)等。 4.趨化抑制實驗發(fā)現(xiàn),P1肽可顯著抑制急性炎癥模型中各類炎性趨化因子的表達,其他短肽的抑制率并不理想,可以認為它可能是炎性趨化因子抑制劑的基本骨架或者先導物。 5.根據(jù)短肽序列進行生物合成,利用MTT試驗檢測其對PBMC的活性影響,結果說明P1肽對PBMC細胞的活性并無影響。 6.通過LUMINEX芯片技術檢測P1肽對急性炎癥模型的趨化因子表達的影響情況,試驗結果表明P1肽可以明顯降低各類炎癥相關趨化因子的表達。 7.鈣流試驗結果表明P1肽可以有效抑制炎癥趨化因子與受體的結合概率,而且P1肽本身也不會引起細胞內(nèi)鈣離子的變化,說明P1肽的趨化抑制作用與趨化因子受體并無明顯關系。 8.RT-PCR結果說明在P1肽的作用下,各類趨化因子的mRNA的表達均有明顯的降低,但是TTP的表達并無影響,說明趨化因子mRNA的降低表達并不是通過TTP來實現(xiàn)的,可能涉及到其他功能基因的表達,這均有待于進一步的實驗研究證明。 結論： 1成功篩選得到可有效抑制趨化因子表達的十二短肽； 2活性實驗研究發(fā)現(xiàn)該短肽對細胞不會產(chǎn)生毒副作用； 3作用機制研究發(fā)現(xiàn)P1肽可以抑制各類炎癥相關趨化因子mRNA的表達進而抑制趨化因子的量,但是其具體的抑制機制有待于進一步研究證明。
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【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R363

【參考文獻】

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4 李s，

本文編號：2392564