【摘要】：研究目的(1)探討臍血間充質干細胞可否成功的在體外分離、培養(yǎng)、擴增并誘導成心肌樣細胞；探討臍血來源的間充質干細胞的分離鑒定,經體外擴增、純化的方法以及定向分化成心肌樣細胞的誘導劑5-氮胞苷(5-AZA)作用后的生物學特性；(2)觀察臍血間充質干細胞與心肌細胞在體外共同培養(yǎng),與臍血MSCs共同培養(yǎng)的心肌細胞是否具有抵抗缺氧引起的凋亡;(3)觀察體外進行長期的培養(yǎng)和擴增臍血MSCs,以及對細胞的遺傳物質有修飾作用的試劑5-AZA進行體外誘導后的臍血MSCs的生物安全性；(4)進行重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)對進行骨髓動員,然后分離純化其外周血單個核細胞,將單核細胞經心導管在梗死相關動脈內注射治療的急性心肌梗死患者進行臨床指標的觀察。 方法與結果 第一部分：提取健康妊娠產婦分娩的胎兒臍帶血,分離單個核細胞進行培養(yǎng)、傳代,取第3代以后細胞,用流式細胞儀直接標記分析CD34、CD44、CD90細胞表面標志。用10μmmol/L的5-AZA誘導4周后,倒置顯微鏡下觀察細胞呈類心肌細胞樣改變、透視電鏡觀察：細胞核呈橢圓形,胞漿內可見成束的肌絲,肌絲內可見梭形密體、豐富的糖原顆粒、大量的線粒體、內質網發(fā)達。免疫熒光組化染色體可見：GATA4, cTnI表達陽性的細胞。并檢測細胞β-肌球蛋白重鏈(β-MyHC)基因的表達。5-AZZ作用后細胞進行生長周期分析以及生長曲線描記。結果顯示體外純化擴增后的臍血間充質干細胞含有與骨髓來源的間充質干細胞相同的細胞表面標志,第三代以后細胞純度較高,經5-AZA在體外誘導培養(yǎng),可形成心肌樣細胞,在誘導劑量作用后,基本的生物學特性未發(fā)生改變。 第二部分：將人的心肌細胞置于95%N2-5%CO2缺氧環(huán)境下培養(yǎng)造成模擬心肌缺血損傷模型。實驗結果顯示細胞凋亡與缺氧呈時間依賴性,將人的心肌細胞和人臍血MSCs在缺氧環(huán)境下共同培養(yǎng),臍血MSCs具有抵抗缺氧引起的心肌細胞凋亡的能力。 第三部分：通過對體外長期培養(yǎng)、擴增的臍血MSCs細胞和經5-AZA誘導作用28天后的MSCs細胞的生長曲線和生長周期分析、細胞核型分析、端粒酶活性檢測、細胞周期相關基因表達的檢測以及細胞成瘤實驗來評價試驗用臍血MSCs是否發(fā)生惡性轉化。結果證實：經離體培養(yǎng)、擴增臍血MSCs和經5-AZA誘導分化成心肌樣細胞后不存在基因突變,不具有成瘤性。 第四部分：選擇6例急性心肌梗死的病人,在移植前1周,應用干細胞動員劑,重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)對進行骨髓動員,然后用細胞分離儀對外周血單個核細胞分離純化。分離純化的單核細胞經心導管在梗死相關動脈內注射治療。干細胞移植術后進行隨訪1、3、6月的心電圖、心臟超聲測定左室射血分數(LVEF)、心肌核素顯像。同時與對照組進行比較。隨訪結果顯示：經干細胞移植治療后的患者心功能明顯改善、心電圖上心肌梗死部位有小的R波、心臟內存活細胞較多。 結論：(1)臍血成為繼骨髓之外的另一個MSCs來源。臍血MSCs為心肌細胞移植提供了良好的細胞供體,是心肌干細胞另一來源；(2)心肌細胞凋亡與缺氧呈時間相關性。人臍血MSCs和人的心肌細胞共同培養(yǎng),能有效抵抗缺氧引起的心肌細胞凋亡；(3)通過我們的實驗建立了從細胞水平評價心肌細胞凋亡的方法；(4)臍血MSCs在體外進行長期培養(yǎng)具有正常MSCs細胞的生長速度；(5)在體外進行長期培養(yǎng)擴增的臍血MSCs和經過5-AZA向心肌細胞誘導后的臍血MSCs沒有發(fā)生惡性轉化；(6)干細胞移植治療后的患者心功能明顯改善、心電圖上心肌梗死部位有小的R波、心臟內存活細胞較多。
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【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【參考文獻】

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1 涂向東,張寶珍,朱忠勇;用吐溫20改進骨髓細胞染色體制備方法[J];臨床檢驗雜志;2002年06期

2 朱洪生,連鋒,朱偉,鐘z，

本文編號：2361641