【摘要】： 日本血吸蟲(chóng)病至今仍是一種嚴(yán)重危害公眾健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題。我國(guó)每年要投入大量的人力、物力防治血吸蟲(chóng)病,但由于血吸蟲(chóng)保蟲(chóng)宿主多,釘螺分布廣且難以消滅,再感染頻繁發(fā)生,血吸蟲(chóng)病的流行形勢(shì)仍十分嚴(yán)峻。上世紀(jì)70年代吡喹酮的問(wèn)世,對(duì)血吸蟲(chóng)病具有很好的治療效果,但并不能有效阻斷血吸蟲(chóng)病的傳播,再感染使化療成本顯得相對(duì)昂貴,且大規(guī)模反復(fù)化療有產(chǎn)生抗藥性蟲(chóng)株的潛在危險(xiǎn)。由于血吸蟲(chóng)在終宿主體內(nèi)不繁殖,只要能產(chǎn)生部分免疫保護(hù)作用就可有效降低成蟲(chóng)負(fù)荷,減輕由蟲(chóng)卵遲發(fā)型超敏反應(yīng)引起的蟲(chóng)卵肉芽腫及其纖維化病變所致嚴(yán)重病理?yè)p害,同時(shí)減少蟲(chóng)卵對(duì)環(huán)境的污染,對(duì)控制血吸蟲(chóng)病的流行傳播具有重要意義,因此需發(fā)展血吸蟲(chóng)病疫苗作為化療的重要補(bǔ)充。DNA疫苗作為一種劃時(shí)代的新技術(shù),在抗血吸蟲(chóng)感染領(lǐng)域已進(jìn)行了大量研究,顯示了良好的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的日本血吸蟲(chóng)磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)DNA疫苗,免疫小鼠獲得部分的保護(hù)作用,且在保蟲(chóng)宿主豬研究中發(fā)現(xiàn)除具有抗感染作用外,還能減輕宿主肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫炎癥反應(yīng),肉芽腫平均面積明顯減小。TPI作為一疫苗候選分子,其抗原表位為血吸蟲(chóng)所特有,與哺乳類(lèi)TPI無(wú)免疫交叉反應(yīng),避免了自身免疫的危險(xiǎn),但其免疫保護(hù)作用仍不很理想,推測(cè)其原因之一可能與該疫苗抗原分子在體內(nèi)的表達(dá)量不高有關(guān)。由于宿主和寄生蟲(chóng)基因密碼子使用上的偏性,外源抗原進(jìn)入宿主后,外源基因似不能有效表達(dá)。據(jù)報(bào)道,對(duì)曼氏血吸蟲(chóng)的SmGPCR基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化,可顯著增加其表達(dá)量;在HIV和瘧疾等的研究中也有類(lèi)似結(jié)果。體內(nèi)電穿孔是另一種提高目的抗原在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的方法,其可通過(guò)提高DNA疫苗在體內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率,進(jìn)而提高抗原基因的表達(dá),增強(qiáng)保護(hù)性免疫應(yīng)答。熱休克蛋白(HSP)是生物界普遍存在的一類(lèi)高度保守蛋白質(zhì),具有分子伴侶作用并參與抗原提呈過(guò)程,并可利用其自身的免疫原性來(lái)誘導(dǎo)宿主免疫殺傷。HSP作為分子伴侶,甚至可直接將結(jié)合的多肽抗原遞呈給T細(xì)胞,激活特異性CTL和記憶性T細(xì)胞,引發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)。本研究擬構(gòu)建含有密碼子優(yōu)化的TPI基因和mHSP70基因的DNA疫苗,觀察其免疫保護(hù)效果,同時(shí)進(jìn)一步觀察體內(nèi)電穿孔技術(shù)對(duì)增強(qiáng)DNA疫苗免疫保護(hù)作用的效果,并初步探討其作用機(jī)理,。本研究?jī)?nèi)容主要包括: 一、日本血吸蟲(chóng)TPI基因密碼子優(yōu)化 按照哺乳動(dòng)物的密碼子使用偏好,對(duì)日本血吸蟲(chóng)TPI基因進(jìn)行優(yōu)化,使用GeneOptimizer軟件對(duì)SjCTPI基因的253氨基酸中的208個(gè)氨基酸編碼基因進(jìn)行優(yōu)化,但不改變氨基酸。根據(jù)密碼子優(yōu)化后的基因序列,由德國(guó)GENEART公司全基因合成優(yōu)化后的TPI基因(TPI.opt),然后插入pJW4303質(zhì)粒。 二、血吸蟲(chóng)TPI基因密碼子優(yōu)化后的DNA疫苗的構(gòu)建 根據(jù)TPI.opt堿基序列設(shè)計(jì)合成引物擴(kuò)增TPI.opt,再插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1的多克隆位點(diǎn),構(gòu)建成重組質(zhì)粒pcDNA3.1-TPI.opt。根據(jù)mHSP70堿基序列設(shè)計(jì)合成引物擴(kuò)增mHSP70,插入質(zhì)粒pcDNA3.1,構(gòu)建成重組質(zhì)粒pcDNA3.1-mHSP70。根據(jù)TPI.opt(去除終止密碼子)堿基序列設(shè)計(jì)合成引物擴(kuò)增TPI.opt,再插入重組質(zhì)粒pcDNA3.1-mHSP70的mHSP70基因的上游,構(gòu)建成重組質(zhì)粒pcDNA3.1-TPI.opt-mHSP70;根據(jù)TPI(去除終止密碼子)設(shè)計(jì)合成引物擴(kuò)增TPI,再插入重組質(zhì)粒pcDNA3.1-mHSP70的mHSP70的上游,構(gòu)建成重組質(zhì)粒pcDNA3.1-TPI-mHSP70。 三、血吸蟲(chóng)TPI基因密碼子優(yōu)化DNA疫苗免疫保護(hù)作用的研究 60只BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為5組,A組(pcDNA3.1,空質(zhì)粒對(duì)照組)、B組(pcDNA3.1-TPI)、C組(pcDNA3.1-TPI-mHSP70)、D組(pcDNA3.1-TPI.opt)和E組(pcDNA3.1-TPI.opt-mHSP70)。各組小鼠分別肌肉注射相應(yīng)的純化質(zhì)粒DNA,每鼠100μg,每隔2周免疫1次,共3次。末次免疫后4周每鼠經(jīng)腹部皮膚攻擊感染(40±1)條日本血吸蟲(chóng)尾蚴,42d后剖殺,計(jì)數(shù)成蟲(chóng)及肝臟蟲(chóng)卵數(shù)。首次免疫前2天及感染前2天經(jīng)尾靜脈采血檢測(cè)IgG及IgG1、IgG2a的水平。攻擊感染前2d取小鼠脾臟制備單個(gè)脾細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ、TNF的水平。結(jié)果顯示D、E組減蟲(chóng)率分別達(dá)到36.03%、39.03%,,減卵率分別達(dá)到41.71%、46.85%,均分別顯著高于B(減蟲(chóng)率26.28%,減卵率28.35%)、C組(減蟲(chóng)率28.38%,減卵率31.39%)(P＜0.01)。B、C、D、E組小鼠血清都檢測(cè)到特異性IgG及IgG2a,IgG1;IgG2a/IgG1的比值分別為1.73、2.06、2.44、3.09。D、E組小鼠的IL-2、IFN-γ、TNF較B、C、組均有明顯升高,但各組IL-4、IL-5均未檢測(cè)到。表明TPI基因密碼子優(yōu)化后的DNA疫苗相對(duì)于未優(yōu)化TPI DNA疫苗能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高的免疫保護(hù)作用,且誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生較強(qiáng)的以Th1為主的免疫應(yīng)答。 四、體內(nèi)電穿孔技術(shù)增強(qiáng)密碼子優(yōu)化后的TPI DNA疫苗免疫保護(hù)作用的研究 60只BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為5組,A組為(pcDNA3.1,空質(zhì)粒對(duì)照組)、B組(pcDNA3.1-TPI.opt)、C組(pcDNA3.1-TPI.opt-mHSP70),D組(pcDNA3.1-TPI.opt電穿孔)、E組(pcDNA3.1-TPI.opt-mHSP70電穿孔)。各組小鼠分別肌肉注射相應(yīng)的純化質(zhì)粒DNA,每鼠100μg,每隔2周免疫1次,共3次,D、E組每次DNA疫苗免疫后即輔以體內(nèi)電穿孔。末次免疫后4周每鼠經(jīng)腹部皮膚攻擊感染(40±1)條日本血吸蟲(chóng)尾蚴,42d后剖殺,計(jì)數(shù)成蟲(chóng)及肝臟蟲(chóng)卵數(shù)。首次免疫前2天及感染前2天經(jīng)尾靜脈采血檢測(cè)IgG及IgG1、IgG2a的水平。攻擊感染前2d取小鼠脾臟制備單個(gè)脾細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ、TNF的水平。結(jié)果顯示D、E組減蟲(chóng)率分別達(dá)到49.74%、51.64%,,減卵率分別達(dá)到57.04%、61.42%,均非常顯著高于B、C組(P＜0.01)。B、C、D、E組小鼠血清都檢測(cè)到特異性IgG及IgG2a、IgG1;IgG2a/IgG1的比值分別為2.44、3.09、3.82、4.06。D、E組小鼠的IL-2、IFN-γ、TNF較B、C、組均明顯升高,但各組均未檢測(cè)到IL-4、IL-5。本實(shí)驗(yàn)表明體內(nèi)電穿孔技術(shù)可顯著提高日本血吸蟲(chóng)密碼子優(yōu)化后TPI DNA疫苗的免疫保護(hù)作用,減蟲(chóng)率和減卵率均達(dá)到和超過(guò)50%。
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【學(xué)位授予單位】：江蘇省血吸蟲(chóng)病防治研究所
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2357623