【摘要】： 丙型肝炎病毒(HCV)是導(dǎo)致輸血相關(guān)性和社區(qū)獲得性肝炎的主要病原,感染者中大約70%發(fā)展為慢性肝炎,其中20%-30%進(jìn)展到肝硬化,所有感染者罹患肝癌的風(fēng)險增加。目前,唯一可用療法是干擾素(IFN-α)單獨或與利巴韋林聯(lián)合使用,治療費用昂貴,治愈率較低,可能產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。因此,發(fā)展一種抗丙型肝炎病毒的疫苗是目前控制HCV感染的有效策略。 研究表明,HCV感染的有效的預(yù)防與清除,需要強(qiáng)有力的和持久的T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答。在臨床前研究中,DNA免疫已經(jīng)成為一種能夠誘導(dǎo)保護(hù)性T細(xì)胞免疫反應(yīng)的有效和安全的疫苗研發(fā)策略。然而,在非人靈長類動物實驗和人體試驗中,DNA疫苗的免疫原性遠(yuǎn)不及其在小鼠試驗中所表現(xiàn)出的強(qiáng)度。近來有一些提高DNA疫苗免疫原性的策略被應(yīng)用到動物實驗中,包括采用電轉(zhuǎn)的方式提高DNA的攝入量和靶蛋白表達(dá),融合表達(dá)抗原和功能蛋白以改善抗原特異性遞呈,聯(lián)合應(yīng)用免疫刺激劑和分子佐劑以提高免疫應(yīng)答水平等。 HCV實驗性DNA疫苗的研究已有大量報導(dǎo),并有幾種疫苗進(jìn)入臨床試驗。但其人群應(yīng)用的障礙主要為免疫原性不理想。為研發(fā)新型HCV DNA疫苗并探討優(yōu)化其免疫原性的策略,本研究選取文獻(xiàn)報道中已證實的在HCV感染清除中具有重要作用的靶抗原,包括結(jié)構(gòu)蛋白(核殼蛋白C,包膜蛋白E1與E2)與相對保守的非結(jié)構(gòu)蛋白3(NS3),應(yīng)用復(fù)制型(pSCK)或非復(fù)制型(pVRC)質(zhì)粒DNA疫苗載體,分別構(gòu)建了幾種能夠表達(dá)NS3與Core的融合蛋白、E1E2蛋白、NS3及NS3與DEC205融合蛋白的DNA疫苗,瞬時轉(zhuǎn)染鑒定其表達(dá),采用直接注射或注射結(jié)合電轉(zhuǎn)的方式免疫Balb/C小鼠,對其體液與細(xì)胞免疫效果進(jìn)行研究,從而為研發(fā)新型HCV DNA疫苗并優(yōu)化其免疫原性提供依據(jù)。主要研究結(jié)果如下： 1.為比較蛋白疫苗與DNA疫苗在小鼠中的免疫應(yīng)答特點,同時優(yōu)化免疫程序及評價電轉(zhuǎn)對DNA疫苗免疫原性的影響,我們構(gòu)建了NS3與Core融合蛋白的HCV DNA疫苗表達(dá)質(zhì)粒,瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后通過Western blot鑒定其表達(dá),將該DNA疫苗質(zhì)粒采用肌肉注射和皮內(nèi)注射兩種方式免疫小鼠,分別結(jié)合不同電轉(zhuǎn)方式(2針陣列式電極電轉(zhuǎn)或卡鉗式電極電轉(zhuǎn))來提高免疫原性；以C44P蛋白疫苗肌肉注射免疫組為對照；通過ELISA和ELISPOT檢驗不同HCV疫苗的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。結(jié)果表明：DNA疫苗免疫各組誘發(fā)的細(xì)胞免疫反應(yīng)均強(qiáng)于蛋白疫苗組,DNA疫苗各組中肌肉注射組結(jié)合2針陣列式電極電轉(zhuǎn)組要強(qiáng)于單獨肌肉注射組,皮內(nèi)注射結(jié)合卡鉗式電極組要強(qiáng)于皮內(nèi)注射結(jié)合2陣陣列式電極組,各質(zhì)粒注射產(chǎn)生的抗體亞型以lgG1型為主。 2.為比較分析基于復(fù)制型載體pSCK與常規(guī)應(yīng)用的非復(fù)制型載體pVRC的HCV DNA疫苗的免疫原性,分別采用表達(dá)包膜蛋白的pVRC-JFH1-E1E2、pVRC-HeBei-E1E2、pSCK-HeBei-E1E2質(zhì)粒免疫小鼠,應(yīng)用基于HeBei株包膜蛋白序列的特異性肽段或肽庫進(jìn)行的ELISPOT檢測結(jié)果表明：基于復(fù)制型載體構(gòu)建的DNA疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性IFN-γ高于非復(fù)制型載體構(gòu)建的DNA疫苗,且其中皮內(nèi)注射結(jié)合卡鉗電極組產(chǎn)生的反應(yīng)最強(qiáng)。以保守的肽段作為檢測抗原進(jìn)行ELISA分析特異性抗體應(yīng)答,上述各組誘發(fā)產(chǎn)生的IgG滴度均低于1：50。 3.為進(jìn)一步評價新型樹突狀細(xì)胞靶向的分子佐劑(DEC205單鏈抗體分子)對HCV DNA疫苗免疫原性的增強(qiáng)作用,我們構(gòu)建了融合表達(dá)DEC205單鏈抗體分子與HCV NS3的DNA疫苗質(zhì)粒pVRC-DEC-NS3,通過瞬時轉(zhuǎn)染293細(xì)胞鑒定其表達(dá),然后采用皮內(nèi)注射結(jié)合卡鉗電極電轉(zhuǎn)的方式二針快速免疫小鼠,另設(shè)一組以同樣方式注射質(zhì)粒pVRC-DEC和pVRC-NS3的混合物,結(jié)果表明：對于pVRC-NS3單獨免疫或者同pVRC-DEC共同免疫,無論是體液免疫方面還是細(xì)胞免疫方面應(yīng)答水平均較低,但是采用NS3和DEC205的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pVRC-DEC-NS3免疫則免疫原性顯著增強(qiáng)。綜上所述,以HCV結(jié)構(gòu)蛋白Core、E1、E2為靶抗原或者非結(jié)構(gòu)蛋白NS3為靶抗原構(gòu)建的新型DNA疫苗免疫小鼠,均可誘發(fā)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答；應(yīng)用電轉(zhuǎn)技術(shù)有助于提高HCV DNA疫苗的免疫原性,使用皮內(nèi)注射結(jié)合卡鉗電極的注射方案誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞免疫反應(yīng)最強(qiáng)；基于復(fù)制型載體構(gòu)建的DNA疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性IFN-γ高于非復(fù)制型載體構(gòu)建的DNA疫苗,并可降低疫苗應(yīng)用劑量；HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3與DEC205單鏈抗體分子融合表達(dá)構(gòu)成的DNA疫苗(pVRC-DEC-NS3)免疫后誘導(dǎo)的靶抗原特異的體液與細(xì)胞免疫應(yīng)答明顯強(qiáng)于非融合的HCV NS3 DNA疫苗(pVRC-NS3)。上述研究結(jié)果為新型HCV DNA疫苗(也包括其他病毒性疾病DNA疫苗)的研發(fā)及優(yōu)化應(yīng)用提供了重要的科學(xué)依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;丙型肝炎防治指南[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2004年09期

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本文編號：2352647