【摘要】： 目的 動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是一種嚴重危害人類健康的疾病,是導致心肌梗死、腦卒中等疾病的危險因素。目前國內(nèi)外研究熱點多集中于從基因誘導方面研究AS形成的病理機制,近年來證據(jù)表明5-脂氧化酶(5-lipoxygenase,5-LO)途徑在動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展以及動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性中有非常重要的作用。目前已利用5-LO敲除小鼠實驗證明5-LO基因與AS發(fā)病密切相關,但5-LO缺陷小鼠并不能模擬AS病人在5-LO基因高表達狀態(tài)下導致的一系列炎癥反應過程,而5-LO過表達轉基因小鼠模型將克服基因敲除小鼠的不足,可能成為研究AS炎癥機制的理想模型。本實驗利用融合表達載體pEGFP-5LO穩(wěn)定轉染RAW264.7細胞并初步研究其表達情況,通過顯微注射法,建立5-LO過表達轉基因小鼠模型,為探索5-LO基因?qū)S的防治作用奠定基礎。 方法 提取人外周血總RNA作為模版,根據(jù)GenBank中5-LO基因序列設計一對引物,通過RT-PCR方法擴增出2000bp的5-LO基因全長,克隆到pUCm-T載體,通過測序證實序列的正確性。用EcoRⅠ酶切載體pEGFP-C2和pUCm-5-LO連接產(chǎn)物,回收、連接、轉化、鑒定,從而成功構建了pEGFP-5-LO表達質(zhì)粒。將pEGFP-5-LO表達質(zhì)粒體外穩(wěn)定轉染小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞,以轉染空載體pEGFP-C2的RAW264.7細胞作對照,應用RT-PCR和Western-blot方法分析5-LO在RAW264.7細胞中的表達情況。pEGFP-5-LO質(zhì)粒經(jīng)StuI單酶切,QIAquick Gel extraction Kit試劑盒純化回收約6.8kp目的片斷,應用顯微注射法將外源目的基因?qū)胧芫言酥?并將注射后的受精卵移植到同期受孕的假孕母鼠輸卵管中,提取新生小鼠鼠尾基因組DNA,進行PCR和Southern blot方法鑒定,并應用RT-PCR、Western-blot、免疫組織化學等方法分析5-LO基因在轉基因陽性小鼠各組織的轉錄特征和表達情況。 結果 重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、測序等分析等均與預期相符,說明成功構建了pEGFP-5-LO表達質(zhì)粒。通過G418篩選出穩(wěn)定轉染5-LO的RAW264.7細胞株,RT-PCR的方法檢測到.5-LO mRNA的轉錄活性明顯較空白對照及轉染空載體pEGFP-C2的RAW264.7細胞增強(P0.05),進一步用’Western-blot方法檢測到5-LO的蛋白表達水平明顯較空白對照及轉染空載體pEGFP-C2的RAW264.7細胞增強(P0.05),說明轉染成功并且5-LO基因得到表達。顯微注射166枚受精卵,并將90枚注射過的受精卵移植于3只ICR受體小鼠的輸卵管中,得到25只F0代轉基因小鼠。PCR、Southern雜交檢測轉基因陽性鼠7只,編號為1、9、13、17、20、22、24。應用RT-PCR的方法檢測到轉基因小鼠的骨髓細胞、腹腔細胞、腎、脾組織5-LO、FLAP、及下游相關因子的mRNA較正常鼠轉錄增強。Western-blot方法分析得到轉基因陽性鼠骨髓細胞、腹腔細胞、腎、脾組織中5-LO、FLAP蛋白的表達明顯高于正常鼠(P0.05)；免疫組織化學等方法分析得到在轉基因陽性鼠腎、脾組織中5-LO、FLAP蛋白的表達明顯高于正常鼠。 結論 pFGFP-5-LO質(zhì)粒體外穩(wěn)定轉染RAW264.7細胞,可以有效地使5-LO在R NA水平和蛋白質(zhì)水平都具有較正常RAW264.7細胞的高表達；5-LO在小鼠基因組中得到整合并表達,5-LO途徑相關因子上調(diào),5-LO蛋白較正常鼠高表達,說明成功的建立了5-LO過表達轉基因小鼠模型。
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【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R-332

【共引文獻】

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1 叢曉強;孟曉萍;李穎;;基質(zhì)金屬蛋白酶在動脈粥樣硬化中的作用研究進展[J];中國動脈硬化雜志;2007年05期

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1 叢曉強;聯(lián)合檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2、氧化修飾低密度脂蛋白抗體對男性冠心病病人的臨床意義[D];吉林大學;2007年

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本文編號：2343307