【摘要】： 人細(xì)小病毒B19(Human parvovirus B19,簡(jiǎn)稱(chēng)B19病毒)屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬,我國(guó)人群有較高的感染率和發(fā)病率。自我們于1990年首次證實(shí)我國(guó)存在B19病毒感染以后,國(guó)內(nèi)多個(gè)研究機(jī)構(gòu)證明其是我國(guó)孕婦非免疫性流產(chǎn)、兒童急性再生障礙性貧血危象、急性血小板減少性紫癜等疾病的重要病因之一。 B19病毒由一個(gè)二十面體衣殼蛋白包裹一條單鏈DNA(5596bp)組成,這條單鏈DNA編碼一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1)、兩個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1,VP2)和兩個(gè)衣殼蛋白(7.5kDa和11kDa)。VP2蛋白(58kDa)包含在VP1蛋白(83kDa)中,兩者的區(qū)別僅是VP1蛋白N末端的227個(gè)氨基酸,這227個(gè)氨基酸所組成的蛋白叫做VP1獨(dú)特區(qū)蛋白(VP1 unique protein,VP1uprotein)。 B19病毒核苷酸序列有著較大的變異,據(jù)此可分為三個(gè)基因型:Ⅰ型(標(biāo)準(zhǔn)型)、Ⅱ型(類(lèi)似A6型和類(lèi)似LaLi型)、Ⅲ型(類(lèi)似V9型),不同型別間核苷酸序列變異率為10%。我們?cè)趪?guó)家自然科學(xué)基金課題(39870021)的資助下,對(duì)B19病毒中國(guó)流行株(B19-XA株)進(jìn)行基因變異的研究,發(fā)現(xiàn)B19-XA株存在較多變異。尤其是VPlu核苷酸存在的變異,將影響B(tài)19-XA株獨(dú)特的免疫學(xué)特性,這是因?yàn)閂Plu蛋白大部分暴露在病毒表面,能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體,且近期研究發(fā)現(xiàn)VPlu蛋白有磷酸脂酶A_2(phospholipase A_2,PLA_2)活性。PLA_2具有水解脂肪酸和磷脂的能力,在很多疾病的發(fā)生和發(fā)展中扮演重要角色。 鑒于B19病毒有多個(gè)基因型,不同的蛋白抗原位點(diǎn)對(duì)研制診斷試劑及疫苗有很大影響,以及VPlu蛋白在B19病毒致病過(guò)程中起著重要作用,故有必要研究B19-XA株VPlu蛋白的結(jié)構(gòu)對(duì)免疫的影響,這將有助于我國(guó)人群B19病毒感染的防治,能促進(jìn)B19病毒致病機(jī)理及預(yù)防疫苗的研究。 研究目的: 本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖潜磉_(dá)純化VPlu蛋白,通過(guò)軟件分析及圓二色譜儀測(cè)定VPlu蛋白一、二級(jí)結(jié)構(gòu);同時(shí)用VPlu蛋白免疫動(dòng)物,測(cè)定抗VPlu蛋白抗體滴度,并行免疫后小鼠心、肝、肺、腸、關(guān)節(jié)滑膜組織病理檢查;體外觀察VPlu蛋白對(duì)T淋巴細(xì)胞應(yīng)答功能的影響;以及將VPlu蛋白用于建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),判斷其檢測(cè)B19病毒感染的可行性。以初步揭示B19-XA株VPlu蛋白的免疫原性,部分揭示B19病毒感染的致病機(jī)理,促進(jìn)B19病毒感染的防治。 實(shí)驗(yàn)方法: 1.測(cè)序證實(shí)pQE30-VPlu質(zhì)粒中含有VPlu片段將我科構(gòu)建并保存的pQE30-VPlu質(zhì)粒送生物技術(shù)公司測(cè)序證實(shí)包含VPlu基因片段。 2.原核表達(dá)并純化B19-XA株VPlu蛋白將含有pQE30-VPlu質(zhì)粒的E.coli M15菌發(fā)酵,低溫條件下IPTG誘導(dǎo)表達(dá)VPlu融合蛋白,通過(guò)離子交換、分子篩純化重組蛋白,SDS-PAGE鑒定VPlu蛋白及純度情況。 3.B19-XA株VPlu蛋白結(jié)構(gòu)分析與測(cè)定通過(guò)AnthePro 5.0軟件分析VPlu蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu),Hierarchical Neural NetWork method軟件分析VPlu蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu),圓二色譜儀測(cè)定VPlu蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。 4.B19-XA株VPlu蛋白免疫學(xué)特性研究體外觀察VPlu蛋白對(duì)BALB/c小鼠淋巴細(xì)胞應(yīng)答功能的影響;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過(guò)VPlu蛋白免疫BALB/c小鼠,然后測(cè)定抗VPlu蛋白抗體滴度,判斷VPlu蛋白抗原性,并對(duì)免疫后小鼠心、肝、肺、腸、關(guān)節(jié)滑膜行光鏡和電鏡檢查。 5.構(gòu)建ELISA檢測(cè)B19病毒抗體體系采用B19-XA株VPlu蛋白包被酶標(biāo)板,優(yōu)化該檢測(cè)B19病毒IgG、IgM體系,與聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、德國(guó)B19病毒抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行比較,評(píng)價(jià)其一致性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1.通過(guò)Hierarchical Neural Network method分析和圓二色譜儀測(cè)定B19-XA株VPlu蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu),無(wú)規(guī)線團(tuán)所占比例均較大,分別為60.00%和46.10%。 2.用ELISA法檢測(cè)B19-XA株VPlu蛋白免疫BABL/c小鼠產(chǎn)生的抗B19-XA株VPlu蛋白抗體效價(jià),抗原包被量為20ng～50ng間為最佳包被量,小鼠血清稀釋達(dá)1∶16000時(shí)為陽(yáng)性(OD值2.04),提示B19-XA株VPlu蛋白免疫原性和反應(yīng)原性好。 3.經(jīng)B19-XA株VPlu蛋白免疫的BABL/c小鼠的心臟、肝臟、關(guān)節(jié)滑膜存在明顯病理改變。心臟病理改變?yōu)?光鏡提示心肌肌纖維間隙增寬、血管擴(kuò)張;電鏡提示心肌肌纖維溶解、肌纖維間隙大、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肌絲間隙增寬、線粒體水腫及空泡化。肝臟病理改變?yōu)?光鏡提示有壞死區(qū)、血竇擴(kuò)張;電鏡提示肝細(xì)胞有突起,微絨毛腫脹及質(zhì)地變實(shí)、電子密度增高。關(guān)節(jié)滑膜病理改變?yōu)?光鏡提示慢性炎癥改變;電鏡提示滑膜細(xì)胞增多、膠原成分增多。 4.用B19-XA株VPlu蛋白構(gòu)建的B19病毒抗體檢測(cè)ELISA體系與腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、皰疹病毒抗體陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)。最佳包被量為25ng/孔,標(biāo)本血清最佳稀釋倍數(shù)為1∶200。其檢測(cè)B19IgM敏感性為88.37%,特異性為96.15%,與PCR方法一致性好,kappa值＞0.75;與Parvovirus B19 IgM ELISA Kit符合性好(符合率=96.8%)。與Parvovirus B19 IgG ELISA Kit比較kappa值＞0.75,兩種檢測(cè)方法一致性好。 結(jié)論: 1.本研究首次發(fā)現(xiàn)B19-XA株VPlu蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)可變區(qū)所占比例大。揭示其能因此刺激機(jī)體產(chǎn)生多種抗體(包括自身抗體),從而引起機(jī)體多系統(tǒng)多器官的病變,可能與B19病毒感染臨床表現(xiàn)復(fù)雜有關(guān)。 2.B19-XA株VPlu蛋白免疫BALB/c小鼠后能產(chǎn)生特異性抗體,且經(jīng)ELISA檢測(cè)提示血清稀釋度達(dá)1∶16000時(shí)仍為陽(yáng)性,說(shuō)明B19-XA株VPlu蛋白抗原性好。 3.B19-XA株VPlu蛋白免疫后的BABL/c小鼠的心臟、肝臟、關(guān)節(jié)滑膜存在明顯病理改變,提示VPlu蛋白在B19病毒致病譜廣中起重要作用,這可能與VPlu蛋白具有PLA_2活性有關(guān)。 4.用VPlu蛋白構(gòu)建的B19病毒抗體檢測(cè)ELISA體系具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)、方便等優(yōu)點(diǎn)。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R373

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 聶曉晶;人細(xì)小病毒B19 VP1獨(dú)特區(qū)蛋白對(duì)心肌細(xì)胞的影響及機(jī)制[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：2335623