【摘要】： 目的與意義建立并完善小鼠精原干細(xì)胞體外擴(kuò)增的培養(yǎng)體系,并探尋LIF在本體系中對(duì)小鼠精原干細(xì)胞體外增殖的影響。該體系的建立不僅可以為研究精子發(fā)生過程以及干細(xì)胞的自我增殖提供新的技術(shù)平臺(tái),而且將大大促進(jìn)細(xì)胞替代治療、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、生殖細(xì)胞體外基因操作等技術(shù)的發(fā)展。 材料與方法 第一部分:取出生后2～6天的ICR雄性小鼠,脫頸法處死,無菌切取睪丸后,采用兩步酶消法制備單細(xì)胞懸液,添加含GDNF、LIF、EGF、bFGF等生長(zhǎng)因子的特定培養(yǎng)基,以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)作為飼養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。培養(yǎng)后通過BrdU整合實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)傳代至第2代、第5代及第11代精原干細(xì)胞的增殖能力并進(jìn)行比較,采用堿性磷酸酶(AP)染色、免疫熒光及RT-PCR技術(shù)對(duì)傳至第11代的精原干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 第二部分:為進(jìn)一步探索LIF在本培養(yǎng)體系中的作用,我們采用不同細(xì)胞因子組合分組對(duì)小鼠精原干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),在其他實(shí)驗(yàn)條件相同的前提下,實(shí)驗(yàn)組Ⅰ采用GDNF+bFGF+EGF+LIF的組合,而組Ⅱ僅為GDNF+bFGF+EGF,觀察兩種培養(yǎng)體系對(duì)小鼠精原干細(xì)胞體外增殖的影響。在細(xì)胞穩(wěn)定傳至第2代、第5代時(shí),通過計(jì)數(shù)培養(yǎng)孔內(nèi)生殖細(xì)胞克隆數(shù)目、BrdU整合實(shí)驗(yàn)和TUNEL檢測(cè)實(shí)驗(yàn)比較兩組精原干細(xì)胞的體外增殖能力和凋亡率。 第三部分:取9～12周齡ICR雄性小鼠無菌切取睪丸,兩步酶消化后經(jīng)Ficoll富集,沿用新生小鼠體外培養(yǎng)體系,培養(yǎng)后通過BrdU整合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)第5天、第10天、第15天的增殖情況,并采用AP染色及免疫熒光進(jìn)行鑒定。 結(jié)果小鼠精原干細(xì)胞在體外可穩(wěn)定增殖,已傳至第15代,培養(yǎng)所得克隆AP檢測(cè)陽性,標(biāo)記物檢測(cè)GFRα-1~+/Oct-4~+/VASA~+/SCP3~-,基因表達(dá)GFRα-1~+/Oct-4~+/SCP3~-,證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞為處于未分化狀態(tài)的小鼠精原干細(xì)胞。 在其他培養(yǎng)條件相同的前提下,培養(yǎng)第2代時(shí)添加LIF的組Ⅰ生殖細(xì)胞克隆數(shù)目平均每培養(yǎng)孔為70.40±8.06,而組Ⅱ?yàn)槠骄靠?7.60±7.15;培養(yǎng)第5代時(shí)組Ⅰ克隆數(shù)目平均每培養(yǎng)孔為75.20±7.83,而組Ⅱ?yàn)槠骄靠?4.60±6.35,組間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。培養(yǎng)第2代時(shí)第3天、第5天兩個(gè)時(shí)間段組ⅠBrdU陽性率分別為46.07±7.95%、45.09±7.80%,組Ⅱ?yàn)?1.47±3.34%,31.73±3.28%;培養(yǎng)第5代時(shí)兩個(gè)時(shí)間段組ⅠBrdU陽性率分別為66.22±7.51%、62.40±6.38%,組Ⅱ?yàn)?9.68±7.32%,46.30±6.15%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,相同時(shí)間段內(nèi)組ⅠBrdU陽性細(xì)胞率均顯著高于組Ⅱ(P＜0.05)。培養(yǎng)第2代時(shí)第3天、第5天組Ⅰ凋亡率分別為10.67±2.28%、11.06±2.83%;組Ⅱ細(xì)胞凋亡率為10.39±1.92%、11.11±2.37%;培養(yǎng)第5代時(shí)第3天、第5天組Ⅰ凋亡率分別為11.43±1.80%、11.96±2.56%;組Ⅱ細(xì)胞凋亡率為12.12±1.90%、12.30±2.46%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,第3天、第5天兩個(gè)時(shí)間段各實(shí)驗(yàn)組陽性細(xì)胞百分率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由以上結(jié)果可知,LIF可促進(jìn)小鼠精原干細(xì)胞在體外增殖,但無抗凋亡作用。值得注意的是,在不添加LIF的情況下,新生小鼠精原干細(xì)胞也能在體外穩(wěn)定增殖,提示LIF不是新生小鼠精原干細(xì)胞培養(yǎng)體系中必需的細(xì)胞因子。 與新生小鼠相比,成年鼠精原干細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,需10～15天才能形成生殖細(xì)胞克隆,經(jīng)BrdU整合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)培養(yǎng)第5天、第10天、第15天陽性率分別為14.57±2.01%、26.17±3.36%、16.73±2.46%,提示培養(yǎng)細(xì)胞處于增殖狀態(tài)。培養(yǎng)所得生殖細(xì)胞克隆經(jīng)免疫熒光鑒定AP、GFRα-1、VASA均為陽性,而SCP3僅表現(xiàn)為部分單細(xì)胞陽性。但傳代后細(xì)胞逐漸凋亡。 結(jié)論 1.本研究建立了新生鼠精原干細(xì)胞無血清體外培養(yǎng)體系,經(jīng)15次以上穩(wěn)定傳代,保持未分化狀態(tài),為體外探索精子發(fā)生過程和干細(xì)胞研究提供了良好的技術(shù)平臺(tái)。 2.在小鼠精原干細(xì)胞培養(yǎng)體系中LIF并不是必需的,但能夠促進(jìn)小鼠精原干細(xì)胞的體外增殖。 3.成年鼠精原干細(xì)胞可在體外短期擴(kuò)增。
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【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 張茨,胡傳義,王玲瓏;膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體基因GFRα1在小鼠精子再生過程中的表達(dá)和意義[J];中華男科學(xué);2003年09期

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本文編號(hào)：2335279