發(fā)布時間：2018-11-15 14:48

【摘要】：目的:構(gòu)建人TGFβ1基因的RNAi質(zhì)粒載體,為進一步構(gòu)建其RNAi病毒載體奠定基礎(chǔ)。方法:根據(jù)人TGFβ1的mRNA序列選擇3個靶序列并根據(jù)它們設(shè)計合成3對寡核苷酸序列,同時合成1對陰性對照寡核苷酸序列;將以上4對寡核苷酸序列退火后連入pRNA-U6.2/Lenti質(zhì)粒并分別命名為pRNA-U6.2/Lenti-1,pRNA-U6.2/Lenti-2,pRNA-U6.2/Lenti-3,pRNA-U6.2/Lenti-4。酶切和測序鑒定后,將以上重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細胞,運用RT-PCR和ELISA檢測TGFβ1 mRNA和蛋白的表達水平。結(jié)果:酶切和測序證實目的寡核苷酸片段已被準確克隆到pRNA-U6.2/Lenti質(zhì)粒;與對照組相比,pRNA-U6.2/Lenti-1,pRNA-U6.2/Lenti-2轉(zhuǎn)染Hela細胞后,TGFβ1 mRNA水平及蛋白水平的表達量均受到明顯抑制;其中TGFβ1蛋白水平在pRNA-U6.2/Lenti-1組下降79.2%,在pRNA-U6.2/Lenti-2組下降53.7%,統(tǒng)計有顯著性差異(P0.01)。結(jié)論:成功構(gòu)建了人TGFβ1基因的RNAi質(zhì)粒載體,為進一步構(gòu)建其RNAi病毒載體奠定了基礎(chǔ)。目的:構(gòu)建TGFβ1基因RNAi慢病毒載體,為因TGFβ1高表達而致病疾病的基因治療奠定基礎(chǔ)。方法:將第一章實驗得到的最有效的干擾質(zhì)粒pRNA-U6.2/Lenti-1和陰性對照質(zhì)粒pRNA-U6.2/Lenti-4分別與包裝質(zhì)�；旌衔锕厕D(zhuǎn)染293FT細胞,包裝產(chǎn)生病毒載體顆粒。各組病毒載體轉(zhuǎn)染Hela細胞后,運用Real-Time PCR和ELISA檢測TGFβ1 mRNA和蛋白的表達水平。結(jié)果:各pRNA-U6/Lenti質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細胞后能產(chǎn)生高滴度的慢病毒載體顆粒;慢病毒載體感染Hela細胞后,pRNA-U6.2/Lenti-1可以顯著地抑制TGFβ1 mRNA水平及蛋白水平的表達,其中TGFβ1蛋白水平在pRNA-U6.2/Lenti-1組下降90.7%,統(tǒng)計有顯著性差異(P(0.01);陰性對照病毒pRNA-U6.2/Lenti-4對TGFβ1 mRNA水平及蛋白水平無明顯影響。結(jié)論:成功構(gòu)建了人TGFβ1基因RNAi慢病毒載體,為后續(xù)的針對人顳動脈炎的干預(yù)研究提供了良好的實驗工具。目的:觀察RNAi慢病毒載體pRNA-U6.2/Lenti-1阻斷TGFβ1表達對人顳動脈炎的影響并探討其可能機制。方法:將經(jīng)病理活檢確診為顳動脈炎的每一例人顳動脈標(biāo)本(共12例)平均分成4份,分別埋入4只SCID鼠腹部皮下,建立人顳動脈炎-嚴重聯(lián)合免疫缺陷病小鼠嵌合體模型;模型隨機分為對照組、pRNA-U6.2/Lenti-1干預(yù)組、地塞米松干預(yù)組、聯(lián)合干預(yù)組(pRNA-U6.2/Lenti-1聯(lián)合地塞米松)。對照組于皮下顳動脈處注射生理鹽水(100ul);pRNA-U6.2/Lenti-1干預(yù)組于皮下顳動脈處注射針對TGFβ1的RNAi慢病毒載體pRNA-U6.2/Lenti-1(100ul,滴度3.1×10~7TU/ml);地塞米松干預(yù)組于皮下顳動脈處注射地塞米松(4mg/kg);聯(lián)合治療組于皮下顳動脈處注射pRNA-U6.2/Lenti-1(100ul,滴度3.1×10~7TU/ml)及地塞米松(4mg/kg),干預(yù)3周后獲取顳動脈標(biāo)本,采用光鏡觀察干預(yù)后各組人顳動脈炎的炎癥細胞浸潤程度及內(nèi)膜增生程度的變化。運用免疫組化、RT-PCR、Western-blotting分別觀察各組炎性顳動脈干預(yù)后TGFβ1、PCNA、NF-KB、IL-2、MCP-1、ICAM-1、在mRNA及蛋白水平的變化。結(jié)果:1.與對照組相比,慢病毒載體pRNA-U6.2/Lenti-1干預(yù)后炎性顳動脈內(nèi)膜增生程度減輕(P0.05);RT-PCR檢測TGFβ1、PCNA、NF-KB、IL-2在mRNA水平表達下降,Western-blotting檢測TGFβ1、PCNA、NF-KB、IL-2在蛋白水平表達下降(P0.05)。 2.與對照組相比,地塞米松干預(yù)后炎性顳動脈炎性細胞浸潤程度減輕(P0.05);RT-PCR檢測MCP-1、ICAM-1、NF-KB、IL-2在mRNA水平表達下降,Western-blotting檢測MCP-1、ICAM-1、NF-KB、IL-2在蛋白水平表達下降(P0.05)。 3.pRNA-U6.2/Lenti-1及地塞米松聯(lián)合干預(yù)后,炎性顳動脈炎性細胞浸潤程度較對照組減輕(P0.05);炎性顳動脈內(nèi)膜增生程度較對照組及pRNA-U6.2/Lenti-1干預(yù)組均減輕(P0.05)。與對照組比較,TGFβ1、PCNA、MCP-1、ICAM-1、NF-KB、IL-2在mRNA及蛋白水平表達均下降(P0.05);與pRNA-U6.2/Lenti-1干預(yù)組比較,PCNA在mRNA水平及蛋白水平均下降(P0.05)。結(jié)論:1.慢病毒載體pRNA-U6.2/Lenti-1干預(yù)后,可能通過抑制TGFβ1進一步抑制平滑肌細胞增殖,使炎性顳動脈內(nèi)膜增生程度減輕;此病毒載體聯(lián)合地塞米松干預(yù)后,對平滑肌細胞的增殖可能產(chǎn)生協(xié)同抑制作用,更有利于減輕炎性顳動脈內(nèi)膜增生程度。 2.TGFβ1不是致顳動脈炎性細胞浸潤的主要因素,因此慢病毒載體pRNA-U6.2/Lenti-1治療后,不能明顯減輕顳動脈炎性細胞浸潤程度。 3.慢病毒載體pRNA-U6.2/Lenti-1治療后,CD4+T細胞功能下降,可能與TGFβ1下降后NF-KB水平降低有關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R346

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 陳喬爾,吳繼峰,王道斌;增殖細胞核抗原的表達在口腔粘膜上皮癌變診斷中的意義[J];口腔頜面外科雜志;2000年03期

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本文編號：2333603