【摘要】： 研究背景及目的: 急性髓細胞白血病是造血干細胞惡性克隆性疾病,骨髓中白血病細胞大量增殖,抑制正常造血,導致患者中性粒細胞減少、貧血、血小板減少。如果不進行治療,患者將在數周內死于出血和感染。目前對于急性髓細胞白血病的治療,仍然以化療為主,但因大多數化療藥物選擇性差,毒副作用大,對正常機體免疫與造血系統(tǒng)有較大的損害,因此長期大劑量使用受到限制。但由于腫瘤的病因和發(fā)展機制還未充分了解,尚未能有效的防治腫瘤。要抑制腫瘤細胞的生長,一方面可以通過影響細胞周期,使其不能進行正常的有絲分裂,另一方面可以通過促進細胞凋亡,以達到治療目的。 剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)屬真球目弓形蟲科,是一種專性細胞內寄生原蟲,可寄生于人和動物有核細胞內引起弓形蟲病。研究表明弓形蟲可誘發(fā)宿主細胞凋亡。本文探索弓形蟲速殖子培養(yǎng)上清對人急性單核細胞白血病細胞THP-1的細胞增殖抑制和誘導其細胞凋亡。觀察弓形蟲培養(yǎng)上清對體外培養(yǎng)的THP-1細胞的形態(tài)學、細胞周期的影響,探討弓形蟲培養(yǎng)上清是否對THP-1細胞具有增殖抑制作用;觀察弓形蟲培養(yǎng)上清對THP-1細胞凋亡的影響;觀察弓形蟲培養(yǎng)上清作用THP-1細胞后P-p38MAPK信號轉導通路和凋亡基因蛋白Fas、FasL表達的變化,探討弓形蟲培養(yǎng)上清誘導THP-1凋亡的相關機制。 方法: 1.采用倒置顯微鏡觀察THP-1細胞形態(tài)變化情況;采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法測弓形蟲培養(yǎng)上清對THP-1細胞增殖抑制率;采用流式細胞儀(flow cytometry,FCM)檢測細胞凋亡率和細胞周期分布; 2.AO/EB染色觀察細胞凋亡形態(tài)變化,觀察細胞各期特征變化; Annexin V- FITC/PI雙染法檢測弓形蟲培養(yǎng)上清作用后THP-1細胞早期凋亡。 3.免疫疫細胞化學法觀察弓形蟲培養(yǎng)上清處理后細胞內磷酸化P38MAPK(P-p38MAPK)、Fas和FasL蛋白表達及分布變化;采用Western blot檢測弓形蟲培養(yǎng)上清處理前后細胞內P-p38MAPK、Fas和FasL蛋白表達量的變化。 結果: 1.MTT法檢測顯示弓形蟲培養(yǎng)上清能抑制THP-1細胞增殖,并呈時間 濃度依賴性。FCM檢測弓形蟲培養(yǎng)上清作用THP-1細胞72h后,G0/G1期細胞比率明顯上升,而S期比率明顯下降。弓形蟲培養(yǎng)上清作用THP-1細胞72h后均出現凋亡峰,呈濃度依賴性,與對照組比較有顯著差異(p0.01)。 2.弓形蟲培養(yǎng)上清作用THP-1細胞后,經AO/EB染色,在熒光顯微鏡下觀察,可出現明顯的凋亡細胞。早期凋亡細胞,核染色質著綠色呈固縮狀或圓珠狀;晚期凋亡細胞,核染色質為橘紅色并呈固縮狀或圓珠狀。隨著弓形蟲培養(yǎng)上清濃度的增加可見凋亡細胞增多,且以晚期凋亡細胞增多為主,呈濃度依賴性;Annexin V- FITC/PI雙染法顯示弓形蟲培養(yǎng)上清(3.2×107/ml,6.4×107/ml)作用THP-1細胞72h后細胞凋亡率分別為(27.8267±1.1667)%和(45.283 3±1.3372)%,呈濃度依賴性,與對照組比較有顯著差異(p0.01)。 3.免疫細胞化學法檢測藥物處理后P-p38MAPK表達增加,主要分布于細胞核與細胞漿,而陰性對照組僅弱表達。Fas、FasL蛋白上調,主要分布在細胞漿和細胞膜;Western blot法顯示P-p38MAPK、Fas、FasL蛋白表達量隨上清液濃度的增加而增加,呈濃度依賴性。其陰性組、72h的1/2IC50組、IC50組P-p38MAPK蛋白表達水平(相對灰度值)分別為0.2598±0.0132,0.3612±0.0083和0.5056±0.0055;Fas蛋白表達水平分別0.2874±0.0089,0.4268±0.0079和0.5971±0.0109;FasL蛋白表達水平分別為0.2124±0.0141 , 0.2988±0.0280和0.4087±0.0266;差別均有顯著性意義( p 0.01)。 結論: 1.弓形蟲培養(yǎng)上清對THP-1細胞生長具有明顯的增殖抑制作用,呈時間 濃度依賴性。 2.弓形蟲培養(yǎng)上清能影響THP-1細胞周期,抑制細胞增殖,促進細胞凋亡。 3.弓形蟲培養(yǎng)上清誘導THP-1細胞凋亡機制之一可能是通過激活P-p38MAPK/Fas/FasL途徑?
[Abstract]:......
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R382

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本文編號：2331171