【摘要】： 目的 分離、獲取大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞,條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)成血管內(nèi)皮祖細(xì)胞,觀察體外培養(yǎng)主要生物學(xué)特點(diǎn),免疫組化及免疫熒光鑒定。在體外制備豬脫鈣骨基質(zhì)支架,電鏡掃面觀察組織形態(tài)。將血管內(nèi)皮祖細(xì)胞種植在脫鈣骨基質(zhì)支架上,將細(xì)胞-支架復(fù)合體置于生物型壓力反應(yīng)器給予適當(dāng)壓力干預(yù),觀察其形成血管能力。 方法 取50克Wistar大鼠,采用密度梯度離心法結(jié)合差速貼壁篩選法分離出骨髓單個(gè)核細(xì)胞,用條件培養(yǎng)液從原代開(kāi)始誘導(dǎo)培養(yǎng),誘導(dǎo)其形成血管內(nèi)皮祖細(xì)胞,并對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行免疫組化及免疫熒光鑒定。取適當(dāng)大小豬脊柱椎體松質(zhì)骨,通過(guò)組織固定、脫脂、脫鈣等步驟制備出脫鈣骨基質(zhì)支架。取第三代血管內(nèi)皮祖細(xì)胞種植在脫鈣骨基質(zhì)支架,將細(xì)胞-支架復(fù)合物隨機(jī)分為A、B兩組,A組置放在生物型壓力反應(yīng)器,給予1Hz頻率,5%形變壓力值,五天后將細(xì)胞-支架復(fù)合物取出,繼續(xù)培養(yǎng)直至兩周,B組直接培養(yǎng)兩周,觀察兩組支架上的細(xì)胞血管形成能力。RT-PCR檢測(cè)兩組EPCs分化相關(guān)因子mRNA表達(dá)。 結(jié)果 新提取的細(xì)胞呈圓形,大小不一。24小時(shí)差速貼壁,36小時(shí)后可見(jiàn)部分細(xì)胞貼壁,并逐漸出現(xiàn)梭形、三角形、紡錘形或不規(guī)則形等形態(tài)。7天左右出現(xiàn)細(xì)胞集落,中央呈圓形,周?chē)笮渭?xì)胞放射性生長(zhǎng)。10～12天集落細(xì)胞呈單層鋪路石樣生長(zhǎng)。細(xì)胞-支架復(fù)合物電鏡下可見(jiàn)脫鈣骨基質(zhì)孔隙網(wǎng)架結(jié)構(gòu),骨小梁、小梁間隙和骨內(nèi)管腔系統(tǒng)同時(shí)存在,細(xì)胞鋪滿(mǎn)材料表面,臨近細(xì)胞相互融合。A、B兩組HE染色和熒光染色可見(jiàn)血管束形成,且A組細(xì)胞明顯多于B組。用RT-PCR法檢測(cè)兩組EPCs培養(yǎng)后vWF和Flk-1 mRNA的表達(dá)情況,A組表達(dá)明顯強(qiáng)于B組。 結(jié)論 密度梯度離心法結(jié)合差速貼壁法提取血管內(nèi)皮祖細(xì)胞簡(jiǎn)便、快捷,生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定,增殖能力強(qiáng)。可以認(rèn)為血管內(nèi)皮祖細(xì)胞是一種理想的骨組織工程種子細(xì)胞。脫鈣骨基質(zhì)是一種良好的載體支架材料,與血管內(nèi)皮祖細(xì)胞復(fù)合構(gòu)建組織工程骨給予適當(dāng)壓力干預(yù)后能明顯促進(jìn)移植骨的血管化,在修復(fù)骨缺損方面具有臨床應(yīng)用價(jià)值。
[Abstract]:Objective to isolate and obtain rat bone marrow mononuclear cells and induce vascular endothelial progenitor cells in conditioned medium, observe the main biological characteristics of culture in vitro, immunohistochemistry and immunofluorescence identification. Porcine decalcified bone matrix scaffolds were prepared in vitro. Vascular endothelial progenitor cells were implanted on the decalcified bone matrix scaffold and the cell-stent complex was placed in a biologic pressure reactor for appropriate pressure intervention to observe its vascular formation ability. Methods Bone marrow mononuclear cells were isolated from 50 g Wistar rats by density gradient centrifugation combined with differential adherent screening method. The mononuclear cells were cultured in conditioned medium from primary culture to induce endothelial progenitor cells (EPCs). The induced cells were identified by immunohistochemistry and immunofluorescence. The cancellous bone of the appropriate size pig spinal vertebrae was used to prepare the scaffold of decalcified bone by tissue fixation, degreasing and decalcification. The third generation vascular endothelial progenitor cells (VECs) were implanted in the decalcified bone matrix scaffolds. The cell-stent complexes were randomly divided into two groups: group A was placed in a biometric pressure reactor and given 1Hz frequency and 5% deformed pressure. After 5 days, the cell-stent complex was removed and cultured for two weeks. Group B was cultured directly for two weeks to observe the ability of cell angiogenesis. RT-PCR was used to detect the expression of EPCs differentiation related factor mRNA in the two groups. Results the newly extracted cells were round and varied in size. After 24 hours of differential adhesion, some cells could be seen sticking to the wall, and gradually appeared fusiform and triangular. After 7 days, the colony appeared round in the center, and the peripheral fusiform cells grew radially. At 10 ~ 12 days, the colony cells grew like monolayer paving stone. Electron microscope of cell-scaffold complex showed that the porous network structure of decalcified bone matrix, trabeculae, trabecular space and intraosseous lumen system existed simultaneously, the cells were covered with the surface of material, and the adjacent cells fused with each other. Blood bundle formation was observed in group B by HE staining and fluorescence staining, and the number of cells in group A was significantly higher than that in group B. The expression of vWF and Flk-1 mRNA in group A was significantly higher than that in group B after EPCs culture by RT-PCR method. Conclusion the method of density gradient centrifugation combined with differential adherent method is simple, rapid, stable and proliferative. Vascular endothelial progenitor cells are ideal seed cells for bone tissue engineering. Decalcified bone matrix is a good carrier scaffold material. Combined with vascular endothelial progenitor cells to construct tissue engineered bone can obviously promote the vascularization of bone graft after appropriate pressure intervention. It has clinical application value in repairing bone defect.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2328678