發(fā)布時(shí)間：2018-11-11 16:07

【摘要】： 人巨細(xì)胞病毒(HCMV)感染是器官移植術(shù)后的主要而危險(xiǎn)的并發(fā)癥之一,是引起移植受者死亡和移植器官失功的重要原因。HCMV是一種條件病原體,有證據(jù)表明大約有50%~90%的人曾感染過(guò)HCMV并攜帶有特異性的抗體。同其它皰疹病毒一樣,HCMV對(duì)免疫力正常的個(gè)體不具有明顯毒力,而在各種原因引起的免疫功能受到抑制的宿主中可以被激活而發(fā)生感染。器官移植受者術(shù)后預(yù)防及治療排斥反應(yīng)和移植物抗宿主病中使用了大劑量的免疫抑制劑,所以處于免疫低反應(yīng)狀態(tài),易于發(fā)生HCMV活動(dòng)性感染并導(dǎo)致患者移植器官失功甚至死亡。因此,如何快速而精確的診斷HCMV活動(dòng)性感染已成為術(shù)后監(jiān)測(cè)感染狀況、及時(shí)給予抗病毒治療以及判斷預(yù)后的關(guān)鍵。 HCMV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)包括以下幾種方法:病毒培養(yǎng)及病理鑒定、血清特異性抗體HCMV-IgG和HCMV-IgM檢測(cè)、HCMV-DNA的PCR檢測(cè)、抗原學(xué)檢測(cè)和HCMV基因?qū)W的檢測(cè)等方法。根據(jù)臨床應(yīng)用的需要,目前常規(guī)的檢測(cè)方法主要是通過(guò)血清特異性抗體HCMV-IgG和HCMV-IgM的檢測(cè)和通過(guò)免疫熒光技術(shù)(IFA)對(duì)早期抗原pp65(CMV-Ag pp65)的檢測(cè)來(lái)判斷HCMV活動(dòng)性感染。但是對(duì)HCMV晚期抗原pp67的研究涉及較少,其臨床意義尚不明確。同時(shí)HCMV感染與細(xì)胞免疫狀態(tài)的關(guān)系尚不清晰,對(duì)外周血淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定與HCMV活動(dòng)性感染的診斷尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),其特異性與靈敏性缺乏同一性。本研究在此基礎(chǔ)上,引入流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)對(duì)CMV-Ag pp65進(jìn)行檢測(cè)和核酸基礎(chǔ)序列擴(kuò)增法(NASBA)、Reverse Transcription-PCR (RT-PCR)技術(shù)對(duì)HCMV的晚期抗原pp67-mRNA進(jìn)行檢測(cè),評(píng)價(jià)CMV-Ag pp65和pp67-mRNA對(duì)于診斷器官移植術(shù)后HCMV感染、發(fā)病以及預(yù)后的價(jià)值。同時(shí)結(jié)合外周血淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定,討論病人細(xì)胞免疫狀態(tài)和HCMV感染之間的關(guān)系,為臨床準(zhǔn)確有效的分析理解實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供依據(jù)。 一、CMV-Ag pp65和pp67-mRNA對(duì)移植術(shù)后HCMV活動(dòng)性感染的診斷價(jià)值 采集2005年9月~2006年5月的28例器官移植受者(其中肝移植8例、腎移植14例、骨髓移植6例;男16例,女12例;年齡19~54歲,平均38歲)EDTA抗凝血120份,每人至少采集3份連續(xù)的血液樣本列為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。術(shù)后1周、1個(gè)月分別用肝素或EDTA管采血5~7ml,立即送檢。IFA檢測(cè)移植受者外周血中CMV-Ag pp65, NASBA測(cè)定pp67-mRNA,繪制兩組用于診斷HCMV的受試者特征曲線(xiàn)(ROC),比較兩組曲線(xiàn)下面積(AUC)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在120份外周血樣本中,42份樣本CMV-Ag pp65陽(yáng)性(CMV-Ag pp65陽(yáng)性細(xì)胞≥1個(gè)/2×106WBC),23份樣本pp67-mRNA陽(yáng)性。而28例器官移植受者中,9例CMV-Ag pp65和pp67-mRNA均為陽(yáng)性(其中3例CMV-Ag pp65和pp67-mRNA在同一時(shí)間發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性),8例pp65陽(yáng)性而pp67-mRNA陰性,2例CMV-Ag pp65陰性而pp67-mRNA陽(yáng)性。臨床診斷為HCMV病患者4例。在HCMV感染早期無(wú)臨床癥狀病毒潛伏期間, CMV-Ag pp65 ROC的AUC為0.9542,pp67-mRNA ROC的AUC為0.6611,因此CMV-Ag pp65抗原檢測(cè)的靈敏度和特異性均高于pp67-mRNA。而在HCMV臨床癥狀出現(xiàn)感染并治療后期,CMV-Ag pp65 ROC的AUC為0.8300,pp67-mRNA ROC的AUC為0.9232,pp67-mRNA的靈敏度和特異性高于CMV-Ag pp65。根據(jù)ROC查得CMV-Ag pp65陽(yáng)性細(xì)胞10個(gè)/2×105WBC為診斷HCMV活動(dòng)性感染的標(biāo)準(zhǔn)臨界值。 二、器官移植受者外周血中CMV-Ag pp65的FCM檢測(cè) 采集2007年9月~2008年3月中的84例腎臟移植受者EDTA抗凝外周血共145份標(biāo)本。采用IFA對(duì)CMV-Ag pp65進(jìn)行檢測(cè),其檢測(cè)的敏感性為100%,特異性為76.0%。采集9例腎臟移植受者EDTA抗凝外周血共16份標(biāo)本。采用FCM對(duì)CMV-Ag pp65進(jìn)行檢測(cè),其檢測(cè)的敏感性為100%,特異性為54.5%。使用Fisher確切概率檢驗(yàn)對(duì)IFA和FCM兩種不同檢測(cè)方法的檢出效果進(jìn)行比較,結(jié)果兩種檢測(cè)方法的檢出效果無(wú)顯著性差異(P=0.25200.05)。 三、器官移植受者外周血中HCMV pp67-mRNA的RT-PCR檢測(cè) 采集2007年10月~2008年1月的38例腎移植患者(男24例,女14例;年齡17~73歲,平均47歲)的EDTA抗凝血68份。采用RT-PCR檢測(cè)pp67-mRNA,其中3例患者的3份樣本檢出陽(yáng)性(有2例病人的2份樣本中CMV-Ag pp65檢出陽(yáng)性并有1例診斷為CMV病,有1例患者1份樣本CMV-Ag pp65檢出陰性)。 四、器官移植受者抗HCMV抗體血清狀況和淋巴細(xì)胞亞群分類(lèi)與HCMV活動(dòng)性感染的關(guān)系 采集2006年9月~2008年2月的27例器官移植受者(其中肝移植3例、腎移植20例、骨髓移植4例。男20例,女7例,年齡20~54歲,平均37歲)外周血標(biāo)本共27份。使用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)檢測(cè)血清特異性抗體HCMV-IgG和HCMV-IgM,其中所有患者的HCMV-IgG均為陽(yáng)性,HCMV-IgM均為陰性。HCMV非活動(dòng)性感染組的診斷標(biāo)準(zhǔn):未感染組即HCMV-IgG陰性和隱性感染組即HCMV-IgG陽(yáng)性但CMV-Ag pp65檢測(cè)陰性或陽(yáng)性細(xì)胞≤10個(gè)/2×105WBC;HCMV活動(dòng)性感染組的診斷標(biāo)準(zhǔn):HCMV-IgM陽(yáng)性或外周血中CMV-pp65抗原陽(yáng)性細(xì)胞 10個(gè)/2×105WBC。對(duì)27份樣本的CMV-Ag pp65檢測(cè),7份樣本陽(yáng)性并且在臨床均明確診斷為HCMV活動(dòng)性感染。應(yīng)用美國(guó)BD公司CELLQUEST軟件分析淋巴細(xì)胞中CD3~+細(xì)胞、CD4~+細(xì)胞及CD8~+細(xì)胞的百分比,并計(jì)算每例患者CD4~+細(xì)胞與CD8~+細(xì)胞的比值(CD4~+/ CD8~+)。各組數(shù)值均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差( (x|-)±s)表示,采用校正t檢驗(yàn)對(duì)組間均值比較。非活動(dòng)性感染組與活動(dòng)性感染組CD3~+細(xì)胞百分含量分別為(75.96±8.18)%和(67.75±17.39)%,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P= 0.110.05);非活動(dòng)性感染組與活動(dòng)性感染組CD4~+細(xì)胞百分含量分別為(53.37±4.38)%和(29.25±9.38)%,非活動(dòng)性感染組高于活動(dòng)性感染組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P= 0.00010.01);非活動(dòng)性感染組與活動(dòng)性感染組CD8~+細(xì)胞百分含量分別為(20.73±4.45)%和(36.12±15.60)%,非活動(dòng)性感染組低于活動(dòng)性感染組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P= 0.00030.01);非活動(dòng)性感染組與活動(dòng)性感染組CD4~+/ CD8~+比值分別為(2.64±0.53)和(1.07±0.45),非活動(dòng)性感染組高于活動(dòng)性感染組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P= 0.00010.01)。 結(jié)論: 1.CMV-Ag pp65更適于早期HCMV活動(dòng)性診斷,對(duì)于提示臨床開(kāi)始抗病毒治療具有早期快速的意義,同時(shí)可以把外周血中CMV-pp65 Ag陽(yáng)性細(xì)胞10個(gè)/2×105WBC作為診斷活動(dòng)性HCMV感染的標(biāo)準(zhǔn)臨界值;pp67-mRNA檢測(cè)快速、結(jié)果準(zhǔn)確,其陰性結(jié)果可作為結(jié)束抗病毒治療的參考指標(biāo),兩者聯(lián)合監(jiān)測(cè)HCMV,對(duì)于輔助臨床診斷具有很好的價(jià)值。 2.使用FCM與IFA對(duì)CMV-Ag pp65進(jìn)行檢測(cè)的檢出效果沒(méi)有顯著性差異。 3.使用RT-PCR可以對(duì)HCMV pp67-mRNA作出定性的判斷。 4.非活動(dòng)性感染組與活動(dòng)性感染組中CD3~+細(xì)胞百分含量無(wú)明顯差異,即T淋巴細(xì)胞的含量無(wú)明顯差異,因此單純檢測(cè)CD3~+細(xì)胞對(duì)鑒別診斷無(wú)使用價(jià)值。HCMV抗原在體外主要刺激CD8~+細(xì)胞增殖,活動(dòng)性感染組中外周血CD8~+細(xì)胞高于非活動(dòng)性感染組,致使CD4~+細(xì)胞與CD8~+細(xì)胞比值下降,甚至倒置。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R450;R392;R446.6

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2325389