【摘要】：背景和目的 DNA聚合酶β(DNA polymeraseβ,polβ)是一種重要的DNA修復酶,它廣泛存在于哺乳動物細胞內。該酶的主要功能是參與DNA的修復,在堿基切除修復(BER)過程中填補單核苷酸缺口,包括短補丁(單一核苷酸)BER途徑和/或長補丁(幾個核苷酸合并)BER途徑,是現(xiàn)今已知堿基切除修復中最重要的聚合酶之一。該酶在哺乳類動物細胞的同源性和在結構進化過程中的高度保守性說明其在生命活動中起著重要作用,有人稱其是生物進化過程的“看家酶”。該酶的缺陷與一些腫瘤的發(fā)生有關。目前,已在食管癌、胃癌、直腸癌、前列腺癌、鼻咽癌等多種人類腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了polβ基因的突變及表達異常。近年來,許多學者對polβ在腫瘤組織和細胞系中的突變及表達狀態(tài)進行了系統(tǒng)的研究。然而,腫瘤組織中突變polβ的功能改變尚未見有報道。因此,本課題在課題組先前研究的基礎上,構建162位Val→Ala突變型DNA聚合酶β(DNA聚合酶βM162突變型)和野生型DNA聚合酶β表達載體,誘導表達、純化得到的重組蛋白,檢測它們對單堿基缺失DNA底物的修復能力,為探討修復基因DNA聚合酶β突變在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用積累實驗依據(jù)。 實驗方法 設計一對帶有BamHⅠ和HindⅢ酶切位的polβcDNA引物;分別以含有野生型polβcDNA克隆pGEM-T-Wpolβ和162位Val→Ala突變型DNA聚合酶β(M162突變型)cDNA克隆pGEM-T-Mpolβ的質粒為模板進行PCR擴增;BamHⅠ和HindⅢ酶切Wpolβ和Mpolβ擴增產物,將其重組入pQE80L;利用PCR篩選和酶切鑒定得到pQE80L-Wpolβ和pQE80L-Mpolβ,進行DNA序列測定。1mmol/LIPTG分別誘導含有pQE80L-Wpolβ和pQE80L-Mpolp的大腸桿菌DH5α,37℃誘導培養(yǎng)5h;超聲破碎細胞,并通過紫外分光光度法測定蛋白含量。然后15%SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍R-250染色,甲醇-冰醋酸脫色并觀察,采用凝膠分析系統(tǒng)掃描,分析SDS-PAGE后凝膠上的染色條帶。 通過Hislink~(TM)蛋白純化試劑盒純化蛋白,純化的蛋白按常規(guī)法用8M尿素復性,通過紫外分光光度法測定蛋白含量,將得到的野生型和突變型DNA聚合酶β蛋白都稀釋為400ng/ml。設計合成帶有HindⅢ酶切位點的單堿基缺失DNA底物的三條單鏈P1、P2和P3,退火后合成含有一個堿基缺失的DNA底物;稀釋野生型和突變型DNA聚合酶β蛋白對DNA底物進行堿基缺失的DNA底物的修復,HindⅢ酶切修復DNA底物,判定BER活性。 實驗結果 1.重組表達載體pQE80L-Wpolβ和pQE80L-Mpolβ經(jīng)PCR和酶切鑒定,證實載體構建成功。DNA序列測定,證實表達載體的插入片段與pGEM-T-Wpolβ和pGEM-T-Mpolβ中序列完全一致。 2.通過誘導表達、純化得到的39KD的野生型和突變型polβ蛋白,與預期的融合蛋白大小一致。 3.三條單鏈P1、P2、P3退火后合成含有一個堿基缺失的56bp的DNA底物,與預期大小相符。 4.在BER實驗中,1:4稀釋即polβ100ng/ml時,野生型polβBER活性為100%,而突變型polβBER活性僅為29%±4%;1:8稀釋即polβ50ng/ml時,野生型polβBER活性為78%±9%,而突變型polβBER活性僅為5%±1.3%;1:16稀釋即polβ25ng/ml時,野生型polβBER活性仍然有32%±4%,而突變型polβBER活性已經(jīng)降為0%;統(tǒng)計學分析,在三個稀釋度上,野生型polβBER活性都顯著高于突變型polβ,p＜0.01,差異均有非常顯著性。 結論 DNA聚合酶βM162突變型,即DNA 598位T突變?yōu)镃,引起polβ氨基酸162位Val突變?yōu)锳la,導致polβ蛋白活化結構域“掌部”空間結構改變,致使BER活性顯著降低。
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【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R346;R73-3

【參考文獻】

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本文編號：2316517