【摘要】：一、研究背景和目的 登革病毒是黃病毒科黃病毒屬的單股正鏈RNA病毒,由11kb的核酸編碼衣殼蛋白C,前膜蛋白prM和包膜蛋白E等3種結(jié)構(gòu)蛋白以及7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B,和NS5)。登革病毒主要以埃及伊蚊以及同屬伊蚊的白紋伊蚊為傳播媒介。依據(jù)數(shù)學(xué)模型的估計,全球每年約有5000萬感染病例發(fā)生,而在登革病毒流行的熱帶和亞熱帶地區(qū),發(fā)生率正在逐年上升。感染登革病毒后可能表現(xiàn)為無癥狀或輕微的自限性的發(fā)熱或登革熱(DF),但也可以發(fā)展為嚴(yán)重的危及生命的疾病即登革出血熱(DHF)和登革休克綜合征(DSS)。登革出血熱(DHF)和登革休克綜合征(DSS)的主要癥狀是血管內(nèi)血液的流失伴隨著血細(xì)胞比容的上升、血壓的下降和漿液性滲出,這些均為疾病發(fā)展進(jìn)展過程中血管內(nèi)皮損傷導(dǎo)致。 登革病毒曾經(jīng)被視為一種非神經(jīng)毒性病毒。由于因登革病毒引起神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的病例較少,這在一定程度上限制了登革病毒在神經(jīng)病學(xué)方向的發(fā)展。1976年,Sanguansermsri等首次將不同尋常的神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)和登革病毒感染聯(lián)系在了一起。從那以后,在登革病毒感染發(fā)生病例中,描述與神經(jīng)系統(tǒng)癥狀相關(guān)癥狀的報告逐漸增多。雖然各種神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的確切發(fā)病率仍然不清楚,但是登革病毒感染時最常見的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥——腦病和腦炎的發(fā)病率則介于0.5%至6.2%之間。然而,在死于登革病毒感染的人群中,這個比例明顯高于那些從登革病毒感染中恢復(fù)的人群。巴西東北部Ceara'州的流行區(qū)域內(nèi),在致命性登革病毒感染人群中,中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染癥狀的發(fā)生率甚至高達(dá)48.8%。同時,最近的眾多觀察數(shù)據(jù)也表明,登革病毒感染的臨床表現(xiàn)正在發(fā)生改變,神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)的報道也更為頻繁。 登革病毒感染引起的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀曾經(jīng)被認(rèn)為是由血液的外滲、腦水腫、低鈉血癥、肝或腎功能衰竭而引起的腦病,而不是由于登革病毒侵犯局部中樞神經(jīng)系統(tǒng)而導(dǎo)致的腦炎。然而,一例兒童尸檢的組織學(xué)檢查中找到了登革病毒抗原的報告,證明了登革病毒性腦炎的存在。同時,在登革病毒性腦炎患者的腦脊液(CSF)中分離出登革病毒,運(yùn)用免疫組化,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)等技術(shù)在下橄欖核以及小腦的顆粒層中檢測到了登革病毒的存在,在神經(jīng)元,小膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中也觀察到了登革病毒的免疫原性反應(yīng),這些均為登革病毒擁有神經(jīng)毒性提供了強(qiáng)而有力的證據(jù)。 眾所周知,血腦屏障(BBB)是一個介于血液循環(huán)系統(tǒng)和腦組織之間的對物質(zhì)通過有選擇性阻礙作用的獨(dú)特膜性結(jié)構(gòu),血腦屏障可以保護(hù)大腦免受有害物質(zhì)的入侵。血腦屏障主要由三個功能性結(jié)構(gòu)組成：(1)物理屏障,由細(xì)胞間的緊密連接組成(2)低效率內(nèi)吞作用的細(xì)胞們本身(3)代謝屏障,主要由內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的特定膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白起作用。然而,即使有這個屏障,一些病毒如登革熱病毒,西尼羅河病毒和東部馬腦炎病毒仍然能夠通過一些未知的機(jī)制進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)。 由于組成血腦屏障的細(xì)胞們直接暴露于外周血液系統(tǒng)中的游離病毒中,那么登革病毒在作為血腦屏障細(xì)胞重要組成的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中感染和復(fù)制,可能成為登革病毒進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的一個重要途徑。病毒感染血腦屏障中的血管內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致血腦屏障的性能改變的機(jī)制已經(jīng)在幾種病毒的感染機(jī)制中得以體現(xiàn),特別是那些能夠?qū)е录毙陨窠?jīng)退行性疾病和神經(jīng)炎癥的病毒,比如猴免疫缺陷病毒(SIV)、麻疹病毒和人類T-淋巴細(xì)胞白血病病毒。此外,游離的登革病毒也可以在不改變血的腦屏障完整性的情況下通過轉(zhuǎn)吞胞作用機(jī)制通過血腦屏障。或者,通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達(dá)從而允許游離的病毒以及病毒感染后的細(xì)胞得以進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。例如,艾滋病毒和猴免疫缺陷病毒感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)時即能夠誘導(dǎo)腦微血管細(xì)胞的緊密連接蛋白(TJP)和細(xì)胞粘附分子(CAM)的表達(dá)發(fā)生改變,導(dǎo)致帶有高病毒載量的被感染炎癥細(xì)胞以“特洛伊木馬”的形式進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。此外,動物研究已經(jīng)表明,登革病毒感染時能夠使得IFN-γ、IL-6和MCP-1等細(xì)胞因子釋放增加,導(dǎo)致登革病毒更容易突破血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。因此,本研究則以描述登革病毒感染人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞為特點(diǎn),重點(diǎn)研究其感染對緊密連接蛋白(TJP)和粘附蛋白(CAM)的表達(dá)。同時,被感染細(xì)胞上清的中的細(xì)胞因子的變化也是重點(diǎn)監(jiān)測對象。 二、研究方法 1.登革3型病毒感染人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)的感染動力學(xué)研究冰上仔細(xì)研磨實驗室儲存的登革3型乳鼠鼠腦,獲取病毒原液后感染單層C6/36細(xì)胞,置于28℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),逐日觀測細(xì)胞,待約超過80%細(xì)胞出現(xiàn)CPE時,收集細(xì)胞及上清,以獲取病毒富集液；采用TCID50的方法對富集的病毒液進(jìn)行毒力滴定后,以感染復(fù)數(shù)(MOI)為5的病毒量感染HBMEC,于24h,48h,72h,96h觀測HBMEC的CPE現(xiàn)象；收集該時間點(diǎn)感染后的細(xì)胞上清,采用Taqman探針法RT-PCR的方法,檢測其中病毒拷貝數(shù)的變化以確定登革3型病毒能否感染HBMEC并能在其中進(jìn)行復(fù)制；采用免疫熒光檢測技術(shù),檢測以上時間點(diǎn)的細(xì)胞中登革3型病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的表達(dá)變化情況,以進(jìn)一步確定登革3型病毒感染HBMEC的感染方式。 2.登革3型病毒感染人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)對血腦屏障中緊密連接的影響 采用Primer5.0以及Oligo7.0設(shè)計與評估人血腦屏障緊密連接相關(guān)的蛋白基因ZO-1,Claudin-1, Occludin-1的上下游引物；收集MOI為5的登革3型病毒感染后不同時間點(diǎn)的HBMEC細(xì)胞,采用RNA提取試劑盒提取不同時間點(diǎn)細(xì)胞的mRNA,然后采用SYBG染料法的RT-QPCR檢測這些緊密連接相關(guān)基因在感染后不同時間點(diǎn)的變化；收集MOI為5的登革3型病毒感染后不同時間點(diǎn)的HBMEC細(xì)胞,采用RIPA裂解液裂解后獲取細(xì)胞蛋白,采用Western-blot技術(shù),檢測細(xì)胞中緊密連接相關(guān)蛋白在感染后的變化趨勢,以評估登革3型病毒感染HBMEC后對血腦屏障緊密連接產(chǎn)生的影響。 3.登革3型病毒感染人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)后對白細(xì)胞粘附的影響。 采用Primer5.0以及Oligo7.0設(shè)計與評估人血腦屏障中與白細(xì)胞粘附相關(guān)的蛋白基因RANTES, E-selectin, PEC AM, VCAM-1, ICAM-3的上下游引物；收集MOI為5的登革3型病毒感染后24h,48h,72h,96h不同時間點(diǎn)的HBMEC細(xì)胞,采用RNA提取試劑盒提取不同時間點(diǎn)細(xì)胞的mRNA,然后采用SYBG染料法的RT-QPCR檢測這些與白細(xì)胞粘附相關(guān)基因在感染后不同時間點(diǎn)的變化；收集MOI為5的登革3型病毒感染后不同時間點(diǎn)的HBMEC細(xì)胞,采用RAIP裂解液裂解后獲取細(xì)胞蛋白,采用Western-blot技術(shù),檢測在RT-QPCR中顯示變化明顯的白細(xì)胞粘附蛋白在感染后的變化趨勢,以評估登革3型病毒感染HBMEC后對血腦屏障緊密連接產(chǎn)生的影響。 4.登革3型病毒感染人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)后上清中細(xì)胞因子的變化。 收集MOI為5的DV3感染后24h,48h,72h不同時間點(diǎn)的HBMEC培養(yǎng)上清以及未感染時的細(xì)胞培養(yǎng)上清各2ml,采用基于夾心法ELISA原理的蛋白芯片檢測這些時間點(diǎn)上細(xì)胞因子的變化趨勢,對于蛋白芯片檢測出有意義的細(xì)胞因子,采用western-blot方法對這些細(xì)胞因子進(jìn)行進(jìn)一步的確認(rèn)。 三、結(jié)果 1.登革3型病毒感染人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)的感染動力學(xué)研究 登革3型病毒能夠感染HBMEC,并在其中復(fù)制。通過光學(xué)顯微鏡觀察感染后HBMEC,可見隨著感染時間的延長,HBMEC逐漸縮小,變圓,并從培養(yǎng)瓶上脫落漂浮于培養(yǎng)液中；而感染后的細(xì)胞上清中登革病毒拷貝數(shù)逐漸減小,及病毒滴度上升；感染后的HBMEC采用免疫熒光技術(shù)觀察后可見細(xì)胞中NS1表達(dá)比例逐漸增加。 2.登革3型病毒感染人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)對血腦屏障中緊密連接的影響 采用QPCR檢測與人血腦屏障緊密連接相關(guān)的蛋白基因ZO-1, Claudin-1, Occludin-1中, ZO-1, Claudin-1均于感染后24h后會應(yīng)激性的增加mRNA的表達(dá)量,而后其表達(dá)量又會急速下降至正�；蚋�,隨著感染時間的延長,逐漸恢復(fù)到正常水平。Western-blot進(jìn)一步確認(rèn)時,ZO-1, Occludin-1均在感染的第2天出現(xiàn)表達(dá)高峰,而后逐漸降低,到第四天最為明顯。而Occludin-1的mRNA表達(dá)量微小的增加在WB分析中沒有檢測到有意義的變化。3.登革3型病毒感染人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)后對白細(xì)胞粘附的影響。 采用QPCR檢測與人血腦屏障細(xì)胞粘附相關(guān)的蛋白基因RANTES, E-selectin, PEC AM, VCAM-1, ICAM-3中, VCAM-1與RANTES均于感染后48h后明顯的增加,VCAM-1最大高峰為感染后第二天,并持續(xù)高于對照組,RANTES較早時期與正常水平接近,最大高峰為感染后第三天。而在采用Western-blot進(jìn)一步確認(rèn)時,僅RANTES的蛋白表達(dá)量與QPCR結(jié)果一致,而VCAM-1的表達(dá)沒有檢測到有意義的變化。E-selectin, PECAM在感染后的mRNA及WB檢測中均沒有明顯變化。4.登革3型病毒感染人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)后上清中細(xì)胞因子的變化。 對于未感染組和感染后的24h,48h,72h的細(xì)胞培養(yǎng)上清,同時檢測了常見的23種與白細(xì)胞趨化、炎癥反應(yīng)、抗病毒等密切相關(guān)的細(xì)胞因子,其中GM-CSF、IL-13、MCP-2、MIG、RANTES等在感染后24h,48h,72h的量超過對照組的1.5倍,IFN-7以及MCP-1同樣有輕度的增加,對于這些因子是否有確切的意義需要進(jìn)一步的western-blot檢測。四、結(jié)論1.作為血腦屏障重要組成的HBMEC,在登革3型病毒感染HBMEC的感染動力學(xué)研究中,我們通過感染后的CPE現(xiàn)象,感染后細(xì)胞上清中病毒拷貝數(shù)qRT-PCR,感染后細(xì)胞中NS1的表達(dá)的免疫熒光檢測,證實了登革3型能夠感染HBMEC導(dǎo)致其產(chǎn)生CPE現(xiàn)象,同時能夠在其中復(fù)制且能夠?qū)?fù)制的子代病毒釋放到培養(yǎng)的細(xì)胞上清中。這種感染方式和登革病毒的易感細(xì)胞如單核細(xì)胞及BHK-21類似能夠持續(xù)在細(xì)胞中復(fù)制,并伴隨著CPE。因此,可以猜測登革3型病毒能夠直接感染HBMEC并釋放病毒,這種細(xì)胞穿胞途徑可能成為登革3型病毒跨越血腦屏障進(jìn)入CNS的途徑之一。 2.在本研究中,登革3型病毒感染HBMEC后能夠?qū)ρX屏障中緊密連接的相關(guān)的基因如ZO-1以及Claudin-1在mRNA水平的表達(dá)呈現(xiàn)為感染首日應(yīng)激性大幅度的增加,而在感染的隨后幾日中又會下降到正常水平或接近正常水平,在相應(yīng)蛋白的WB檢測中,ZO-1的表達(dá)同樣在首日應(yīng)激性增加后,隨后感染的幾日的表達(dá)相對未感染組下調(diào),這可能是緊密連接蛋白對感染后細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子的一種應(yīng)答表現(xiàn)。而ZO-1在連接跨膜蛋白與細(xì)胞骨架蛋白之間起著重要的中心作用,而隨著感染時間的延長,其表達(dá)量的下降可能導(dǎo)致血腦屏障滲透性增加,使得登革3型病毒能夠通過細(xì)胞旁途徑進(jìn)入CNS。 3.被感染的單核巨噬等易感細(xì)胞能夠以“特洛伊木馬”的形式進(jìn)入CNS,使得病毒更易在中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中擴(kuò)散。而被感染的HBMEC能夠?qū)е掳准?xì)胞粘附相關(guān)的蛋白(CAM)以及趨化其粘附的RANTES表達(dá)上調(diào),這些蛋白能夠促進(jìn)被感染的單核巨噬細(xì)胞更容易進(jìn)入CNS,這表明“特洛伊木馬”機(jī)制可能是形成登革腦炎的一個重要原因。 4.在登革3型病毒感染HBMEC后的細(xì)胞上清中,GM-CSF、IL-13、MCP-2、 MIG、RANTES等細(xì)胞因子的表達(dá)量出現(xiàn)超過1.5倍的上升,IFN-7以及MCP-1同樣有輕度的增加。而在研究已經(jīng)表明這些細(xì)胞因子主要與白細(xì)胞的趨化、生成及成熟均有密切的關(guān)系,而上清中RANTES與被感染的細(xì)胞中的表達(dá)趨勢保持一致,這些都表明了登革3型病毒感染HBMEC時,能夠形成局部的炎癥反應(yīng),趨化白細(xì)胞的聚集以及作用。這些將在后續(xù)的研究中得到進(jìn)一步的證實。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R373

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2312989