【摘要】： 第一部分有效轉(zhuǎn)染DRG細胞TRPV4SiRNA的濃度篩選 目的:建立大鼠背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal root ganglion,DRG)細胞基因轉(zhuǎn)染細胞模型,觀察在SiRNA轉(zhuǎn)染下培養(yǎng)24h和48h的神經(jīng)元形態(tài)和活性的變化,篩選這種神經(jīng)元siRNA轉(zhuǎn)染的濃度。 方法:取新生Wistar大鼠腰背段全部DRG,將處理好的DRG神經(jīng)元進行培養(yǎng),根據(jù)時間,將神經(jīng)元隨機分為正常對照組、SiRNA不同濃度組、在SiRNA中培養(yǎng)相應時間后觀察各組神經(jīng)元在熒光顯微鏡的形態(tài)學特點,并用MTT法分析各組神經(jīng)元細胞生長活性的改變。另外采用 結(jié)果:熒光顯微鏡下觀察SiRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)組DRG神經(jīng)元形態(tài)較正常組五無明顯差異。MTT法比較10-40nM各組神經(jīng)元活性的差異無統(tǒng)計學意義。利用FLUO3熒光探針,觀察SiRNAa作用下細胞內(nèi)游離鈣對低滲溶液的反應,采用ELISA方法觀察KCL刺激下各組細胞釋放P物質(zhì)的改變, 結(jié)論:40-80nMSiRNA可以有效轉(zhuǎn)染DRG細胞,并對細胞內(nèi)游離鈣對低滲溶液的反應產(chǎn)生影響,并且對釋放P物質(zhì)也有抑制作用,同時未對DRG神經(jīng)元活性產(chǎn)生顯著影響,此方法有望成為一種在分子水平研究TRPV4通道對DRG神經(jīng)元的影響的有效細胞模型。 第二部分RNA干擾抑制大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞的TRPV4表達 目的TRPV4(transient receptor potential vanilloid 4)是大鼠背根神經(jīng)節(jié)傷害性傳導的重要感受器,本實驗擬應用體外轉(zhuǎn)錄合成的SiRNA轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元,誘導非選擇性鈣離子通道TRPV4基因表達沉默,觀察對TRPV4表達以及功能的影響,探討以TRPV4為靶點、采用RNA干擾的方法進行疼痛研究的應用前景,為TRPV4的功能研究提供新的方法。 方法根據(jù)RNA干擾的原理及SiRNA的設(shè)計原則,設(shè)計2對長度為19bp的TRPV4基因SiRNA(SiRNAa和SiRNAb),另選擇相同長度的無義雙鏈RNA作為陰性對照RNA體外轉(zhuǎn)錄合成SiRNA,將SiRNA轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元,采用熒光定量RT-PCR,Western blot檢測TRPV4mRNA以及蛋白的表達。 結(jié)果SiRNA可以有效轉(zhuǎn)染DRG細胞,并在低滲條件下引起細胞TRPV4表達的明顯降低。SiRNAa和SiRNAb可以分別使得TRPV4mRNA降低,在低滲狀態(tài)下,對照組與錯配組mRNA的表達均明顯增高,分別為正常細胞外液的3.88以及3.75倍。而SiRNAa組則為1.26倍,SiRNAb組為1.87倍,明顯抑制了TRPV4的mRNA表達(P=0.0187,P＜0.05)。對照組與錯配組蛋白表達的表達均明顯增高,分別為正常細胞外液的3.26倍以及3.56倍。而SiRNAa為1.01倍,SiRNAb為1.28倍,也表現(xiàn)出明顯的抑制作用(P=0.0028,P＜0.05)。以上實驗篩選出A序列更為有效。 結(jié)論TRPV4是一個在低滲狀態(tài)信號轉(zhuǎn)導的重要組成部分。本實驗所設(shè)計的SiRNA可以在DRG神經(jīng)元內(nèi)有效抑制TRPV4mRNA和蛋白的表達水平,并且可以有效抑制TRPV4的功能。因此,SiRNA有可能成為TRPV4相關(guān)的病理狀態(tài),尤其是疼痛的潛在治療方式。本實驗篩選出的序列SiRNAa將為以后的實驗提供實驗依據(jù)。 第三部分:大鼠背根神經(jīng)節(jié)上TRPV4通道蛋白功能的抑制 背景TRPV4在炎性痛和神經(jīng)痛感覺傳導中有重要的作用,我們既往的研究也表明,TRPV4在背根神經(jīng)節(jié)慢性受壓的病理改變中也起到一定的作用。盡管我們在以上的實驗中觀察到TRPV4SiRNA可以有效抑制mRNA和蛋白的表達,但是我們對TRPV4SiRNA是否能抑制其功能并不明確。本實驗擬應用體外轉(zhuǎn)錄合成的SiRNA轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元,觀察TRPV4的功能改變。 方法SiRNAa另選擇相同長度的無義雙鏈RNA作為陰性對照RNA體外轉(zhuǎn)錄合成SiRNA,將SiRNA轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元,采用共聚焦顯微鏡的方法,利用FLUO3熒光探針,觀察SiRNAa作用下細胞內(nèi)游離鈣對低滲溶液的反應,采用ELISA方法觀察KCL刺激下各組細胞釋放P物質(zhì)的改變,同時本實驗采用細胞免疫化學的方法觀察了TRPV4與PKC表達的相關(guān)性。 結(jié)果DRG細胞中鈣濃度變化,30%低滲溶液引起的DRG細胞中鈣濃度峰值在對照組以及錯配組中均有明顯的升高,(p＜0.01).而與以上兩組對照,SiRNAa組DRG對低滲溶液的反應明顯降低,p＜0.01。P物質(zhì)釋放的檢測結(jié)果表明,Kcl刺激前后,對照組以及錯配組有明顯的P物質(zhì)釋放增多,SiRNAa以及SiRNAb組則出現(xiàn)明顯的抑制作用(P=0.023,P＜0.05)。免疫細胞化學的結(jié)果表明SiRNA組細胞熒光明顯降低減弱.光密度值檢測有統(tǒng)計學意義.(p＜0.05). 結(jié)論TRPV4是一個在低滲狀態(tài)信號轉(zhuǎn)導的重要組成部分。本實驗所設(shè)計的SiRNA可以有效抑制TRPV4的功能。因此,SiRNA有可能成為TRPV4相關(guān)的病理狀態(tài),尤其是疼痛的潛在治療方式。本實驗篩選出的序列SiRNAa將為以后的實驗提供實驗依據(jù)。序列;為以后的研究奠定基礎(chǔ)。另一方面,明確RNAi是否可以在DRG細胞中有效抑制TRPV4基因和蛋白的表達,同時抑制TRPV4的功能活性。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R346

【參考文獻】

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1 楊向東;劉真;劉花香;王麗紅;馬春紅;李振中;;神經(jīng)生長因子對培養(yǎng)的大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元P物質(zhì)釋放的調(diào)節(jié)作用(英文)[J];Neuroscience Bulletin;2007年04期

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本文編號：2267111