發(fā)布時間：2018-10-08 15:38

【摘要】： 長期以來人們認為成年哺乳動物心臟處于后有絲分裂期,即心臟是終末分化器官,不具備自我更新的能力。心臟內有絲分裂的發(fā)現,使人們認識到心臟內有可能存在著干細胞。新近的一些實驗結果證實了心臟干細胞的存在,這些發(fā)現立即受到生物醫(yī)學界的高度關注。 現在已經從成年人和其他哺乳動物心臟中分離得到了心臟干細胞。通過細胞移植或是原位激活,心臟干細胞都有能力再生肌細胞,并能改善心臟功能。然而各家報道的心臟干細胞分離培養(yǎng)的方法不盡相同。關于心臟干細胞在分化前的離子通道特性至今未見報道。本實驗致力于建立一種有效的、重復性好的成年小鼠心臟干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定方法,并在此基礎上研究心臟干細胞在分化前存在的離子通道的類型及其特性。 第一部分成年小鼠心臟干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 成年小鼠心臟干細胞的分離采用Langendorff法灌流小鼠心臟,用膠原酶酶解法制備單個心肌細胞,差速離心法將較大的細胞(如心室肌細胞)和較小的細胞分離開。取用較小細胞,用c-kit抗體孵育后,然后用免疫磁珠分離法分離心臟干細胞。結果顯示,分離出的細胞數約104個,細胞形態(tài)為圓形,鏡下觀察較亮,每個細胞上帶有一個或者多個磁珠,細胞直徑較小,約在4～10μm之間。 成年小鼠心臟干細胞的培養(yǎng)分離的細胞先在有血清培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)48小時以除去貼壁雜細胞,然后將懸浮細胞轉移到另一新培養(yǎng)皿中,在改良神經干細胞培養(yǎng)基條件下繼續(xù)培養(yǎng)。結果顯示,在培養(yǎng)兩天后,有少量細胞開始貼壁,培養(yǎng)五天后,較多細胞開始貼壁生長,七到十天后,形成小克隆,并可持續(xù)生長。 成年小鼠心臟干細胞的鑒定新鮮分離的原代細胞和傳代培養(yǎng)后的細胞采用免疫熒光法鑒定其表型,在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察熒光。結果顯示,原代細胞和傳代細胞表面都帶有綠色熒光,證明其表型為c-kit,心臟干細胞傳代培養(yǎng)后其表型沒有發(fā)生變化。此結果說明,傳代后細胞保持了干細胞特性,沒有發(fā)生分化。 第二部分成年小鼠心臟干細胞離子通道特性 培養(yǎng)的小鼠CSCs在貼壁生長形成較大克隆之后,用0.25%胰蛋白酶消化,當大部分細胞回縮變圓之后,用血清終止消化。細胞一部分用于傳代,一部分保存用于膜片鉗實驗。應用全細胞膜片鉗記錄方法,在電壓鉗模式下記錄離子通道電流。結果顯示,未分化的成年小鼠心臟干細胞上存在離子電流。我們記錄到兩種類型的電流,一種為外向電流,激活速度較慢,另一種為內向電流。大部分的心臟干細胞上所記錄到的電流為外向電流,激活速度緩慢,呈電壓依賴性,具有非失活特性。此外向電流對TEA敏感,能被TEA可逆性的抑制,該電流為延遲整流鉀電流(IKDR)。 結論:(1)采用膠原酶酶解,免疫磁珠分離法分離,能夠分離出較純的,數目較多的心臟干細胞;(2)分離出的心臟干細胞具有再生和克隆能力;(3)新鮮分離的心臟干細胞具有c-kit表型,傳代培養(yǎng)后c-kit表型依然存在;(4)未分化的成年小鼠心臟干細胞上存在延遲整流鉀電流(IKDR)。
[Abstract]:It has long been seen that the heart of the adult mammalian heart is in the post-mitotic phase, i.e. the heart is the terminal-differentiated organ and does not have the ability to self-update. The discovery of mitosis in the heart makes it possible to recognize that there may be stem cells in the heart. Recent experimental results confirm the presence of cardiac stem cells, which are now highly concerned by the biomedical community. The heart has now been isolated from the heart of adults and other mammals Stem cells. Cell transplantation or in situ activation, cardiac stem cells have the ability to regenerate muscle cells, and can improve heart dirty. However, the methods of separating and culturing cardiac stem cells in various reports do not To do the same. Ion channel characteristics prior to differentiation of heart stem cells have not yet been This experiment is devoted to the establishment of an effective and reproducible method for the isolation, culture and identification of cardiac stem cells in adult mice, and on the basis of which the types of ion channels present before differentiation of cardiac stem cells are studied. characterized in that the first part is divided into annual mouse heart stem cells Isolation, culture and identification of cardiac stem cells in adult mice were isolated by Langendorff method, and the hearts of mice were perfused with collagenase. The preparation of a single myocardial cell by the enzymatic method, the differential centrifugation method takes larger cells (e.g., ventricular myocytes). Cells are separated from smaller cells. Smaller cells are taken, incubated with c-kit antibodies, and then immunomagnetic The results show that the number of isolated cells is about 104, the morphology of the cells is round, the observation is bright under the mirror, one or more magnetic beads are provided on each cell, and the diameter of the cells is small. The cells cultured and isolated from adult mouse heart stem cells are first cultured in serum medium for 48 hours to remove adherent heteroatoms, and then suspended cells are transferred to another culture dish, The results showed that after two days of incubation, a small number of cells began to adhere, after five days of incubation, more cells began to adhere to the wall and seven to ten. After days, small clones were formed and allowed to grow continuously. The identification of fresh isolated primary and post-infected cells in adult mouse heart stem cells was identified by immunofluorescence Phenotyping, fluorescence was observed under a laser scanning confocal microscope. The results showed that both primary and passaged cells had green fluorescence to demonstrate that their phenotype was c-kit, There was no change in the phenotype of cardiac stem cells. Post-generation cells retain stem cell characteristics without differentiation In the second part of adult mouse cardiac stem cell ion channel characteristics, CSCs were cultured on adherent growth with 0. 25% after the formation of larger clones. Trypsin digestion, after most of the cells shrink back to a circle, use serum terminate the digestion. A portion of the cell is used for passage, and a portion of the cells are stored for an oral test. recording the ion channel electricity in the forceps mode by using the whole cell method of recording and recording. Flow. The results showed that there was an ionic current in the undifferentiated adult mouse heart stem cells. We recorded two types Current, an outward current, slower activation, and the other is the inward current. The current recorded on most of the heart stem cells For external current, the activation speed is slow, voltage dependent, and has non-deactivation characteristic. This external current is sensitive to TEA and can be Conclusion: (1) collagenase enzymatic hydrolysis and immunomagnetic bead separation can be used to separate and separate more pure and larger number of heart stem cells; (2) isolated cardiac stem cells. There was regeneration and cloning ability; (3) fresh isolated cardiac stem cells had c-kit phenotype, and c-kit phenotype was still present after decapsulation; (
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R329

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本文編號：2257311