【摘要】： 目的建立受四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)外源基因Mst1的真核表達(dá)體系人胚腎293(HEK293)細(xì)胞株,用于進(jìn)一步基因功能的研究。方法利用T-REx (Tetracycline - Regulated Expression)系統(tǒng)建立四環(huán)素可調(diào)控的表達(dá)體系。首先,構(gòu)建含有目的基因Mst1的質(zhì)粒pcDNA4/TO-Mst1。其次,將調(diào)節(jié)性pcDNA6/TR質(zhì)粒用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞,經(jīng)藥物Blasticidin S篩選后的克隆用有限稀釋法進(jìn)行單克隆化。單克隆擴增后再瞬時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA4/TO-Mst1并用Zeocin篩選并挑選單克隆。然后經(jīng)四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá),通過Western Blot方法檢測目的基因Mst1的表達(dá)水平,從而篩選出由四環(huán)素誘導(dǎo)的高表達(dá)外源基因Mst1的人胚腎293單克隆細(xì)胞株。結(jié)果通過T-REx系統(tǒng)成功構(gòu)建由四環(huán)素調(diào)控的高表達(dá)外源基因Mst1的人胚腎293細(xì)胞株。結(jié)論四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)目的基因Mst1的人胚腎293細(xì)胞株可用于外源基因的真核調(diào)控表達(dá),為研究目的基因Mst1及其它真核基因功能提供了一種有力的實驗手段。 目的探討四環(huán)素誘導(dǎo)性表達(dá)外源性Mst1(Mammalian sterile 20-like kinase 1)對HEK 293細(xì)胞增殖與凋亡的影響。方法在已經(jīng)成功構(gòu)建的四環(huán)素可誘導(dǎo)表達(dá)Mst1的HEK 293細(xì)胞系中,加入四環(huán)素誘導(dǎo)Mst1在HEK293細(xì)胞中高表達(dá)。通過蛋白Western Blot分析Mst1在HEK 293細(xì)胞中的表達(dá)情況;分別在加入四環(huán)素后12, 24,36,48小時通過四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)觀察高表達(dá)Mst1后對細(xì)胞增殖的影響;加入四環(huán)素后36小時加入BrdU,通過其摻入比率來顯示Mst1對細(xì)胞增殖的影響;加入四環(huán)素后后36小時,加入順鉑作用14小時后通過Annexin V檢測其對細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果四環(huán)素成功誘導(dǎo)Mst1高表達(dá);MTT及BrdU結(jié)果顯示在HEK 293細(xì)胞中高表達(dá)Mst1后細(xì)胞增殖明顯受到抑制;Annexin V檢測結(jié)果提示高表達(dá)Mst1后,細(xì)胞的凋亡率相對增高。結(jié)論在HEK 293細(xì)胞中高表達(dá)Mst1,不僅可以抑制細(xì)胞增殖,還可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
[Abstract]:Objective to establish an eukaryotic expression system of human embryonic kidney 293 (HEK293) cell line which was induced by tetracycline to express exogenous gene Mst1 for further study of gene function. Methods T-REx (Tetracycline-Regulated Expression) system) was used to establish a tetracycline regulatory expression system. Firstly, the plasmid pcDNA4/TO-Mst1. containing the target gene Mst1 was constructed. Secondly, the regulatory pcDNA6/TR plasmid was transfected into human embryonic kidney 293 cells by liposome-mediated method, and the clone screened by drug Blasticidin S was monoclonal by limited dilution method. After amplification, the plasmid pcDNA4/TO-Mst1 was transiently transfected and Zeocin was used to screen and select the monoclonal. After tetracycline induced expression, the expression level of target gene Mst1 was detected by Western Blot method, and then the human embryonic kidney 293 cell line with high expression of exogenous gene Mst1 induced by tetracycline was selected. Results the human embryonic kidney 293 cell line was successfully constructed by tetracycline regulated by T-REx system with high expression of exogenous gene Mst1. Conclusion Tetracycline induced human embryonic kidney 293 cell line expressing the target gene Mst1 can be used to regulate the eukaryotic expression of exogenous gene, which provides a powerful experimental means for studying the function of the target gene Mst1 and other eukaryotic genes. Objective to investigate the effects of tetracycline induced expression of exogenous Mst1 (Mammalian sterile 20-like kinase 1 on proliferation and apoptosis of HEK 293 cells. Methods Tetracycline induced high expression of Mst1 in HEK293 cells was found in HEK 293 cell line which was successfully constructed by tetracycline induced expression of Mst1. The expression of Mst1 in HEK 293 cells was analyzed by protein Western Blot, and the effect of high expression of Mst1 on the proliferation of HEK 293 cells was observed by (MTT) assay. The effect of Mst1 on cell proliferation was demonstrated 36 hours after adding tetracycline and Annexin V by Annexin V at 36 hours after adding tetracycline and 14 hours after adding tetracycline. Results Tetracycline successfully induced the high expression of Mst1 and BrdU results showed that the proliferation of HEK 293 cells was significantly inhibited after high expression of Mst1. The results of Annexin V assay showed that the apoptosis rate of HEK 293 cells increased after the high expression of Mst1. Conclusion overexpression of Mst1, in HEK 293 cells can not only inhibit cell proliferation, but also promote apoptosis.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R692;R346

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 鄧友平,肖培根;神經(jīng)酰胺和細(xì)胞凋亡[J];國外醫(yī)學(xué).遺傳學(xué)分冊;1997年01期

2 梅立新,張旭晨,李洪燕;細(xì)胞凋亡[J];河北醫(yī)學(xué);1997年03期

3 林紅伍;細(xì)胞凋亡與腫瘤[J];醫(yī)學(xué)新知雜志;1997年04期

4 陳智;牙齒發(fā)育中的細(xì)胞凋亡[J];國外醫(yī)學(xué).口腔醫(yī)學(xué)分冊;1997年06期

5 李積勝,徐鵬霄,賀智;缺鋅對大鼠睪丸細(xì)胞凋亡的影響[J];武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報;1997年02期

6 余國膺;細(xì)胞凋亡:研究現(xiàn)狀和待解決的關(guān)鍵課題[J];中國實驗診斷學(xué);1998年05期

7 馬東初;孫英慧;馬小峰;�？�;黃世林;白月輝;初俊杰;劉亞革;;不同濃度亞砷酸鈉對誘導(dǎo)NB_4細(xì)胞凋亡能力的影響[J];沈陽部隊醫(yī)藥;1998年06期

8 陳學(xué)清;潘國宗;;抗單鏈DNA抗體的制備及其在細(xì)胞損傷檢測中的應(yīng)用[J];國外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊);1998年03期

9 李增燦,陳志彪;胰腺癌局部治療與細(xì)胞凋亡[J];中國腫瘤臨床與康復(fù);1999年01期

10 胡擁軍;;心力衰竭的心肌細(xì)胞凋亡及調(diào)控[J];國外醫(yī)學(xué).老年醫(yī)學(xué)分冊;1999年02期

相關(guān)會議論文 前10條

1 崔曉燕;羅瓊;楊明亮;劉軍;閆俊;李卓能;;枸杞多糖對人前列腺癌PC-3細(xì)胞生長及其凋亡的影響[A];中國環(huán)境誘變劑學(xué)會第14屆學(xué)術(shù)交流會議論文集[C];2009年

2 廖斌;張逸;皇甫真萍;齊彥;陳佳薇;陳益寧;;中藥復(fù)方君子湯誘導(dǎo)急性白血病細(xì)胞凋亡的實驗研究[A];第12屆全國實驗血液學(xué)會議論文摘要[C];2009年

3 黃小瓊;饒子亮;劉盛來;鐘志勇;王剛;嚴(yán)家榮;陳系古;;已烯雌酚對免疫性卵巢早衰小鼠卵巢細(xì)胞凋亡的影響[A];實驗動物與藥理學(xué)、毒理學(xué)研究學(xué)術(shù)交流會論文匯編[C];2009年

4 王首帆;戴杏;雷鐵池;徐世正;;Dct基因敲除增強抗Ro/SSA血清注射小鼠UVA誘導(dǎo)表皮細(xì)胞凋亡[A];中華醫(yī)學(xué)會第十五次全國皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2009年

5 曹珍山;朱茂祥;劉國廉;;放射性核素誘發(fā)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)及基因表達(dá)定量分析[A];第九屆中國體視學(xué)與圖像分析學(xué)術(shù)會議論文集[C];2001年

6 楊素榮;姚明輝;;細(xì)胞因子GM-CSF、IL-3和GM-CSF/IL-3融合蛋白對輻射致Tf-1細(xì)胞凋亡的影響[A];第六屆全國藥理學(xué)教學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2003年

7 林玲;潘孔寒;;膿毒血癥患者外周血白細(xì)胞凋亡與病情及預(yù)后關(guān)系[A];2005年浙江省危重病學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2005年

8 孟祥東;嚴(yán)云勤;;環(huán)境雌激素體外誘導(dǎo)雄性小鼠生殖細(xì)胞凋亡及其分子機制的研究[A];第十屆全國生殖生物學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2005年

9 左小兵;孫濤;謝彬;;曲古菌素A誘導(dǎo)髓系白血病細(xì)胞株U937細(xì)胞凋亡的分子途徑研究[A];第10屆全國實驗血液學(xué)會議論文摘要匯編[C];2005年

10 李盛華;姚正凱;;激素性股骨頭壞死細(xì)胞凋亡的實驗研究進(jìn)展[A];第十四屆全國中西醫(yī)結(jié)合骨傷科學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2006年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 陳漢橋;大連提出急性胰腺炎細(xì)胞凋亡新論[N];中國醫(yī)藥報;2001年

2 鐘顯飛 蔣明德;四川實驗證實:紅景天苷可誘導(dǎo)HSC細(xì)胞凋亡[N];中國醫(yī)藥報;2005年

3 張中橋;四軍醫(yī)大西京醫(yī)院研究證明：GS能誘導(dǎo)白血病K562細(xì)胞凋亡[N];中國醫(yī)藥報;2005年

4 李明輝;“細(xì)胞凋亡”治癌癥[N];醫(yī)藥導(dǎo)報;2002年

5 張中橋;銀杏葉提取物能減少細(xì)胞凋亡[N];中國中醫(yī)藥報;2007年

6 溫紅;蛋白質(zhì)caspases 3／7能有效控制細(xì)胞凋亡[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2006年

7 商東;“細(xì)胞凋亡”與臨床醫(yī)學(xué)[N];中國醫(yī)藥報;2001年

8 洪敏;細(xì)胞凋亡研究引人關(guān)注[N];中國醫(yī)藥報;2008年

9 康 旭 冼沛中 許慶文;復(fù)方苦參注射液促使大腸癌細(xì)胞凋亡的實驗研究[N];中國中醫(yī)藥報;2006年

10 記者張建松;治療癌癥新途徑：細(xì)胞凋亡療法[N];科技日報;2002年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 劉光偉;低劑量電離輻射對小鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡的影響及其基因調(diào)控[D];吉林大學(xué);2004年

2 張公文;銀杏葉提取物對大鼠心臟移植心肌細(xì)胞凋亡影響的實驗研究[D];山東大學(xué);2004年

3 劉宗超;實驗性腦出血中NF-κB的作用機制及巴曲酶保護(hù)作用的研究[D];吉林大學(xué);2005年

4 張秀花;針刺對MCAO大鼠缺血半暗帶影響的基礎(chǔ)研究[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2005年

5 吳強;ERK1/2、p38MAPK在魚藤酮中毒誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡和iNOS表達(dá)中的作用研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2005年

6 袁長青;神經(jīng)酰胺和凋亡誘導(dǎo)因子在UVA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2005年

7 劉正學(xué);SARS病毒特異性抗原抗體基因和N基因的研究[D];武漢大學(xué);2005年

8 高巍然;2-甲氧基雌二醇對骨髓瘤細(xì)胞作用的體外實驗研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

9 徐波;糖皮質(zhì)激素對ALL細(xì)胞Bim、Puma表達(dá)的影響及HA14-1誘導(dǎo)ALL細(xì)胞凋亡的途徑[D];中國醫(yī)科大學(xué);2006年

10 馮蕾;瘤內(nèi)注射化療藥物對微波消融肝腫瘤的增敏作用[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 聶林;三氧化二砷對惡性淋巴瘤細(xì)胞凋亡的研究[D];暨南大學(xué);2000年

2 張建軍;細(xì)胞凋亡在腸炎沙門氏菌致腸道屏障功能損傷中的作用[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2001年

3 童炎岳;腎缺血再灌注損傷內(nèi)皮素與細(xì)胞凋亡研究及氨基酸的保護(hù)作用[D];浙江大學(xué);2002年

4 李維婷;伴放線放線桿菌誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞通過Fas-FasL途徑的細(xì)胞凋亡的研究[D];吉林大學(xué);2004年

5 鐘榮德;生長抑素和生長激素對重癥急性胰腺炎胰腺細(xì)胞凋亡的影響[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2004年

6 曾蕓;黃連、黃芩提取物對小鼠胸腺細(xì)胞凋亡的影響[D];廣西大學(xué);2005年

7 李恭賀;水牛卵巢卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的生物學(xué)特征[D];廣西大學(xué);2005年

8 余丹丹;兩株H5N1亞型禽流感病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

9 劉萌;活體細(xì)胞凋亡核素檢測技術(shù)的實驗研究[D];北京大學(xué);2005年

10 劉斌;土槿乙酸的抗腫瘤作用及其作用機制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2005年

，

本文編號：2242722