【摘要】： 目的：中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophils, PMNs)是機(jī)體最重要的炎癥細(xì)胞,它在機(jī)體固有性免疫應(yīng)答中具有重要作用,其胞漿內(nèi)富含的細(xì)胞毒性物質(zhì)既可殺傷外來(lái)入侵的病原微生物,也可造成自身組織細(xì)胞的損傷。研究表明,中性粒細(xì)胞粘附、活化及凋亡的整個(gè)過(guò)程可受Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)的調(diào)節(jié),促成炎癥反應(yīng)的無(wú)損傷性收斂,使機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。其中,TLR4是人們最早發(fā)現(xiàn)的能夠直接介導(dǎo)機(jī)體與病原體反應(yīng)的Toll樣受體。最近,日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)一種與中性粒細(xì)胞的趨化有關(guān)的蛋白DOCK2 (Dedicator of cytokinesis 2),其聚集到中性粒細(xì)胞內(nèi)朝著感染源的一側(cè),使中性粒細(xì)胞改變自身形態(tài),更高效地向感染源移動(dòng)。本課題主要探討DOCK2與中性粒細(xì)胞凋亡的相關(guān)性以及DOCK2與中性粒細(xì)胞上表達(dá)的TLR4之間的聯(lián)系。這為今后更深入研究中性粒細(xì)胞抗感染能力的機(jī)制提供了潛在的依據(jù),也為臨床上治療炎癥性相關(guān)疾病提供了新的靶點(diǎn)。方法：抽取健康成人外周靜脈血,Ficoll密度梯度法分離、純化中性粒細(xì)胞,并利用臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)、懷特-姬姆薩混合染色法鑒定細(xì)胞活力與純度均達(dá)96%以上,按實(shí)驗(yàn)需求構(gòu)建不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停簩?shí)驗(yàn)組(DOCK-2刺激組)、陽(yáng)性對(duì)照組(IL-1β刺激組、TNF-α刺激組)、陰性對(duì)照組(空白組)。運(yùn)用光學(xué)顯微鏡觀察不同培養(yǎng)狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)；用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同組中性粒細(xì)胞的凋亡率；通過(guò)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)TLR4mRNA在各組中的表達(dá)情況；免疫印跡(western blotting)技術(shù)檢測(cè)各組中TLR4的表達(dá)情況。結(jié)果：1.運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DOCK2對(duì)PMNs凋亡是否有影響,結(jié)果顯示：與空白組比較,DOCK2組PMN凋亡率是下降的,具有明顯的差異性(P0.05)。2.RT-PCR技術(shù)檢測(cè)PMNs在不同藥物刺激組中TLR4 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：同空白組相比,DOCK2組TLR4 mRNA的表達(dá)上調(diào),且有明顯的差異性(P0.01)。3.培養(yǎng)6 h后,將各組模型組中的中性粒細(xì)胞裂解,提取總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE并相互比較。結(jié)果顯示：在不同刺激物刺激下,中性粒細(xì)胞上TLR4蛋白質(zhì)表達(dá)的性質(zhì)和數(shù)量發(fā)生了不同程度的改變。4.不同實(shí)驗(yàn)組刺激PMN 6 h后,提取蛋白并用Western blotting檢測(cè)TLR4蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示：同空白組相比,DOCK2組TLR4蛋白的表達(dá)是上調(diào)的,有明顯的差異性(P0.01)。 結(jié)論：1.DOCK2可能對(duì)PMNs的凋亡有延遲作用。2.DOCK2可能對(duì)中性粒細(xì)胞上TLR4的表達(dá)有上調(diào)作用。3.TLR4可能抑制PMN的凋亡。4.DOCK2抑制PMNs凋亡的同時(shí)上調(diào)TLR4的表達(dá)。但也可能前者引起后者,或者后者引起前者。并且,二者變化的量之間可能存在一定的關(guān)系。
[Abstract]:Objective: neutrophil (polymorphonuclear neutrophils, PMNs) is the most important inflammatory cell in the body. It plays an important role in the innate immune response of the body. The cytotoxic substances abundant in the cytoplasm of neutrophil (polymorphonuclear neutrophils, PMNs) can kill the invading pathogenic microorganisms. They can also cause damage to their own tissues and cells. The study shows that the whole process of neutrophil adhesion activation and apoptosis can be regulated by Toll like receptor (Toll-like receptors, TLRs) which can promote the noninvasive convergence of inflammatory response and make the body maintain the homeostasis of the internal environment. TLR4 is the first Toll-like receptor that can directly mediate the reaction between organism and pathogen. Recently, Japanese scientists have discovered a protein DOCK2 (Dedicator of cytokinesis 2 associated with neutrophil chemotaxis, which gathers to the side of the neutrophil towards the source of infection, causing the neutrophil to change its morphology and move more efficiently to the source of infection. The purpose of this study was to investigate the relationship between DOCK2 and neutrophil apoptosis and the relationship between DOCK2 and TLR4 expressed on neutrophils. This provides a potential basis for the further study of the mechanism of neutrophil anti-infection, and provides a new target for clinical treatment of inflammatory diseases. Methods: neutrophils were isolated and purified by Ficoll density gradient method from peripheral venous blood of healthy adults. The viability and purity of neutrophils were identified by trypan blue exclusion assay and White-Giemsa mixed staining method. Different experimental models were constructed according to experimental demands: experimental group (DOCK-2 stimulation group), positive control group (IL-1 尾 stimulation group), negative control group (blank group). The apoptosis rate of neutrophils in different groups was detected by flow cytometry and the expression of TLR4mRNA was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Western blot (western blotting) technique was used to detect the expression of TLR4 in each group. The result is 1: 1. The effect of DOCK2 on PMNs apoptosis was detected by flow cytometry. The results showed that the apoptosis rate of PMN in DOCK2 group was lower than that in control group (P0.05). 2. RT-PCR was used to detect the expression of TLR4 mRNA in different drug stimulated groups. The results showed that the expression of TLR4 mRNA was up-regulated, and there was significant difference (P0.01). 3. After 6 hours of culture, the neutrophils in each group were lysed and the total protein was extracted and compared with each other. The results showed that the nature and quantity of TLR4 protein expression on neutrophils changed in varying degrees under different stimuli. After 6 h stimulation of PMN in different experimental groups, the expression of TLR4 protein was detected by Western blotting. The results showed that the expression of TLR4 protein was up-regulated in the control group (P0.01). Conclusion: 1. DOCK2 may delay the apoptosis of PMNs. 2. DOCK2 may up-regulate the expression of TLR4 in neutrophils. 3. TLR4 may inhibit the apoptosis of PMN. 4. DOCK2 inhibits the apoptosis of PMNs and up-regulates the expression of TLR4. But the former may cause the latter, or the latter may cause the former. Moreover, there may be a certain relationship between the quantity of the two changes.
【學(xué)位授予單位】：瀘州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392.12

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本文編號(hào)：2233280