【摘要】： 小分子半抗原單克隆抗體制備通常較復(fù)雜,且很多情況下,得到的抗體親和力較差,效價很低,無法滿足作為檢測性抗體的要求,在很大程度上限制了單克隆抗體的應(yīng)用。本研究以對硫磷為對象制備了單鏈抗體,旨在探索已知基因的半抗原基因工程抗體的構(gòu)建,同時通過基因工程的方法構(gòu)建了未知抗體基因的抗微囊藻毒素-LR(microcystin-LR, MC-LR)的單鏈抗體,并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了四價抗體,為基因工程抗體在小分子半抗原類物質(zhì)檢測方面的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。 參考GenBank中發(fā)表的對硫磷抗體序列,對其進(jìn)行分析后在重鏈可變區(qū)基因(heavy chain V-region, VH)和輕鏈可變區(qū)基因(light chain V-region, VL)之間加上了45個核苷酸作為連接肽序列,由公司合成。構(gòu)建單鏈抗體表達(dá)載體,經(jīng)過原核表達(dá)得到了可溶性表達(dá)的目的蛋白。SDS-PAGE和Western Blot檢測表明表達(dá)的單鏈抗體分子量為28 kD。用Ni-NTA金屬親和層析法對可溶性表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化,得到的目的蛋白純度為74.8%,ELISA檢測表明該scFv能夠與對硫磷特異性結(jié)合。本實驗為進(jìn)一步制備高特異性、高親和力抗體奠定了基礎(chǔ),并且為基因工程抗體在農(nóng)藥檢測方面的應(yīng)用提供依據(jù)。 以分泌抗微囊藻毒素MC-LR單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞為材料,通過RT-PCR擴(kuò)增出抗體的重鏈和輕鏈全編碼區(qū)cDNA序列。序列分析表明,PCR得到的抗體重鏈序列共1473bp,包括部分VH,完整的CH1、CH2、CH3三個恒定區(qū)和3’端非編碼區(qū),其中VH大小為363bp,編碼121個氨基酸,屬小鼠IgH-V7183 VH5家族;得到的輕鏈序列共880bp,包括部分輕鏈可變區(qū)VL,完整的恒定區(qū)和3’非編碼區(qū),其中VL大小為336bp,編碼112個氨基酸,屬小鼠IGKV21亞組。VH和VL符合小鼠免疫球蛋白可變區(qū)基因特征,均含有4個框架區(qū)、3個抗原互補(bǔ)決定區(qū)及抗體特征性的2個半胱氨酸殘基,且基因內(nèi)無終止密碼子,表明得到的序列為小鼠抗體重鏈和輕鏈基因序列。 分別擴(kuò)增VH和VL,通過重疊延伸PCR將二者拼接,構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-mc。序列分析表明,該scFv基因全長744bp,編碼248個氨基酸。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Origami 2(DE3)進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot分析,單鏈抗體主要以包涵體的形式在大腸桿菌中表達(dá)。在IPTG為0.1 mM,培養(yǎng)溫度為15℃時可溶性表達(dá)產(chǎn)物含量最高。利用Ni-NTA對可溶性表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化,回收到的目的蛋白濃度為0.115 mg/ml。ELISA檢測表明該單鏈抗體能與MC-LR發(fā)生特異性結(jié)合。 為提高單鏈抗體的親和力,利用核心鏈霉親和素的四聚化特性對scFv進(jìn)行多聚化。將scFv基因與核心鏈霉親和素基因拼接,并構(gòu)建四價抗體表達(dá)載體pET-teab。經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot分析,四價抗體主要以不溶性的包涵體的形式表達(dá)。在IPTG為0.1 mM,培養(yǎng)溫度為15℃時可溶性表達(dá)產(chǎn)物含量最高。利用Ni-NTA對可溶性表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化,回收到的目的蛋白濃度為0.179 mg/ml。非還原性SDS-PAGE及Western Blot檢測表明,回收的目的蛋白以四聚體和單體的形式存在,沒有檢測到比四聚體分子量大的分子。ELISA檢測結(jié)果表明,四價抗體與單鏈抗體和單克隆抗體相比,具有更高的親和力。
[Abstract]:The preparation of monoclonal antibodies against small molecule hapten is usually complicated, and in many cases, the antibodies obtained have poor affinity and low titer, which can not meet the requirements of being used as detective antibodies. To a great extent, the application of monoclonal antibodies is limited. In this study, single chain antibodies against parathion were prepared to explore the semi-antibodies against known genes. At the same time, the single chain antibody against microcystin-LR (MC-LR) of unknown antibody gene was constructed by genetic engineering method. On this basis, the tetravalent antibody was constructed, which laid a foundation for the application of genetic engineering antibody in the detection of small molecule hapten substances.
Referring to the sequence of parathion antibody published in GenBank, 45 nucleotides were added between heavy chain V-region (VH) and light chain V-region (VL) genes as ligation peptides. The expression vector of single-chain antibody was constructed and soluble after prokaryotic expression. SDS-PAGE and Western Blot assays showed that the molecular weight of the expressed scFv was 28 kD. The purity of the soluble protein was 74.8% by Ni-NTA affinity chromatography. ELISA assay showed that the scFv could specifically bind to parathion. The high affinity antibody laid the foundation for the application of genetic engineering antibody in pesticide detection.
Hybridoma cells secreting monoclonal antibodies against microcystin MC-LR were used to amplify the full-coding region of the heavy chain and light chain of the antibody by RT-PCR. Sequence analysis showed that the heavy chain sequence of the antibody obtained by PCR was 1473 bp, including some VH, complete CH1, CH2 and CH3 constant regions and 3'-terminal non-coding regions, of which VH was 363 BP in size. It encodes 121 amino acids and belongs to the murine IgH-V7183 VH5 family. The obtained light-chain sequences consist of 880 bp, including partial light-chain variable region VL, complete constant region and 3'non-coding region, of which VL is 336 BP in size and encodes 112 amino acids, belonging to the murine IGKV21 subgroup. The two cysteine residues in the complementary determinant region of antigen and the characteristic antibody, and no termination codon in the gene, indicated that the obtained sequence was the heavy chain and light chain gene sequence of mouse antibody.
Prokaryotic expression vector pET-mc was constructed by splicing VH and VL, respectively. Sequence analysis showed that the scFv gene was 744 BP in length and encoded 248 amino acids. The expression vector was transformed into E. coli Origami 2 (DE3) to induce the expression of the target protein. SDS-PAGE and Western Blot analysis showed that the single chain antibody was mainly an inclusion body. When IPTG was 0.1 mM and culture temperature was 15 C, the soluble expression product was the highest. The soluble expression product was purified by Ni-NTA and the concentration of the recovered protein was 0.115 mg/ml. ELISA detection showed that the SCFv could bind specifically to MC-LR.
In order to improve the affinity of scFv, scFv was polymerized by tetramerization of core streptavidin. The scFv gene was spliced with core streptavidin gene and a tetravalent antibody expression vector pET-teab was constructed. The soluble protein was purified by Ni-NTA and the concentration of the recovered protein was 0.179 mg/ml. The results of non-reducing SDS-PAGE and Western Blot showed that the recovered protein existed in the form of tetramers and monomers, and the molecular weight of the recovered protein was not larger than that of tetramers. Molecular. ELISA results showed that tetravalent antibodies had higher affinity than single chain antibodies and monoclonal antibodies.
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392.1

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本文編號：2229851