【摘要】： 乳桿菌廣泛存在于人和動物腸道、植物表面等生境中。近年來,人們從乳桿菌的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、分類學(xué)、遺傳學(xué)、微生態(tài)學(xué)、生理功能及應(yīng)用等諸多方面對其進(jìn)行廣泛而深入的研究。由于乳桿菌具有很多益生功能,國內(nèi)外已有大量含有乳桿菌的益生菌食品、保健品、藥品等產(chǎn)品問世,并受到消費(fèi)者的普遍歡迎。為了更好的促進(jìn)對乳桿菌的開發(fā)與利用,分離來源于人體腸道的乳桿菌更加具有實(shí)際應(yīng)用價值,因為來源于人體的乳桿菌更加容易在人體腸道中定植。 隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展及生物物理技術(shù)的應(yīng)用,對微生物的鑒定方法已經(jīng)從傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分析、生理生化試驗發(fā)展到以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的各種分子生物學(xué)方法。這些方法鑒定微生物不需要繁瑣的微生物培養(yǎng),通過設(shè)計的屬及種的特異性引物或探針,可以很容易的將微生物鑒定到種的水平,利用分子標(biāo)記技術(shù)甚至可以將微生物鑒定到株的水平。單純的依靠傳統(tǒng)生理生化鑒定方法對微生物進(jìn)行鑒定,得出的結(jié)果不夠可信,須與分子生物學(xué)方法相結(jié)合,才能對微生物進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。 本研究包括四方面內(nèi)容: 1.乳桿菌的分離純化 以健康成人及學(xué)齡兒童的新鮮糞便為樣品,經(jīng)過稀釋涂布于MRS培養(yǎng)基。通過形態(tài)學(xué)觀察及H2O2酶、糖發(fā)酵等生理生化試驗對所分得菌株進(jìn)行初步鑒定,記錄形態(tài)學(xué)特性、生理生化鑒定結(jié)果及糖發(fā)酵鑒定結(jié)果,得到乳桿菌56株。 2. 16S rDNA序列同源性分析(Sequence Homology Analysis)方法鑒定乳桿菌 16S rDNA序列同源性分析方法的具體步驟包括:乳桿菌基因組DNA的提取,PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物測序及同源性分析。將選擇的20株試驗菌株的測序結(jié)果與GenBank中該屬內(nèi)菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行同源性分析,從而準(zhǔn)確鑒定所分得菌株。最終得到嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)1株,卷曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus)1株,食竇魏斯氏菌(Weissella. cibaria)1株,唾液乳桿菌唾液亞種(Lactobacillus salivarius subsp. salivarius)1株,黏液乳桿菌(Lactobacillus mucosae)2株,戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)1株,發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)5株,植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)8株。 3.變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)技術(shù)構(gòu)建乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜 采用PCR-DGGE技術(shù)對試驗菌株進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)圖譜的構(gòu)建,選擇基因組DNA的16S rDNA的V7-V8可變區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,35~55%變形梯度凝膠電泳分離效果較好,觀察指紋圖譜發(fā)現(xiàn),試驗菌株大致分為7類。PCR-DGGE結(jié)果與鑒定結(jié)果不完全一致,說明DGGE方法也存在一定的局限性。 4.擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphic DNA, AFLP)技術(shù)初步研究乳桿菌的遺傳多態(tài)性 從64對隨機(jī)引物中篩選出來的1對多態(tài)性較好的引物用來分析乳桿菌屬種間的遺傳多態(tài)性。反復(fù)試驗證明AFLP指紋圖譜重復(fù)性好,準(zhǔn)確度高,所得的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖顯示出乳桿菌屬內(nèi)相同種不同菌株之間的遺傳多態(tài)性,說明AFLP技術(shù)可作為乳桿菌同種不同菌株之間多態(tài)性研究的依據(jù)。 本試驗針對健康人的腸道菌群,采用傳統(tǒng)生理生化方法與分子生物學(xué)方法相結(jié)合,對20株分離自健康人新鮮糞便中的乳桿菌進(jìn)行鑒定到種的水平,通過變性梯度凝膠電泳(DGGE)方法構(gòu)建了試驗乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜,并利用擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)技術(shù)初步研究了不同乳桿菌菌株之間的遺傳多態(tài)性。為多角度開發(fā)我國乳酸菌資源、益生菌菌種的篩選以及腸道微生態(tài)保健品的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Lactobacillus is widely distributed in human and animal intestinal tract, plant surface and other habitats. In recent years, Lactobacillus has been extensively and thoroughly studied from morphology, physiology, taxonomy, genetics, microecology, physiological function and application. Lactobacillus has many beneficial functions, and a large number of Lactobacillus contain Lactobacillus at home and abroad. In order to promote the development and utilization of Lactobacillus, isolation of Lactobacillus from human intestinal tract has more practical value, because Lactobacillus from human intestine is easier to colonize in human intestine.
With the rapid development of molecular biology and the application of biophysical technology, the identification methods of microorganisms have developed from traditional morphological analysis, physiological and biochemical experiments to various molecular biology methods based on PCR technology. These methods do not require complicated microbial culture to identify microorganisms through the design of genera and species. Heterosexual primers or probes can easily identify microorganisms to the level of species, and molecular marker technology can even be used to identify microorganisms to the level of strains. Conduct accurate identification.
This study includes four aspects:
Isolation and purification of Lactobacillus 1.
Fifty-six strains of Lactobacillus were isolated from fresh feces of healthy adults and school-age children by diluting and coating on MRS medium.
Identification of lactobacillus by 2. 16S rDNA sequence homology analysis (Sequence Homology Analysis)
The specific steps of 16S rDNA sequence homology analysis include: genomic DNA extraction, PCR amplification, product sequencing and homology analysis of Lactobacillus spp. Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus crispatus, Weissella. cibaria, Lactobacillus salivarius subsp. salivarius, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus pentosus, fermentation 5 strains of Lactobacillus (Lactobacillus fermentum) and 8 strains of Lactobacillus plantarum (Lactobacillus plantarum).
3. Construction of Lactobacillus standard fingerprint by denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
The V7-V8 variable region sequence of 16S rDNA of genomic DNA was amplified by PCR-DGGE. 35-55% deformable gradient gel electrophoresis was used to isolate the V7-V8 variable region sequence of genomic DNA. Fingerprints showed that the tested strains could be divided into 7 groups. The results of PCR-DGGE were inconsistent with those of identification, indicating that DGGE method was also effective. There are some limitations.
4. Preliminary Study on Genetic Polymorphism of Lactobacillus by Amplified Fragment Length Polymorphic DNA (AFLP)
A pair of primers with good polymorphism was selected from 64 pairs of random primers to analyze the genetic polymorphism of Lactobacillus spp. AFLP fingerprint was proved to be repeatable and accurate by repeated experiments. The polyacrylamide gel electrophoresis map showed the genetic polymorphism of the same strain in Lactobacillus spp. It indicated that AFLP technique was effective. It can be used as a basis for studying polymorphism of different strains of Lactobacillus.
In this study, 20 strains of Lactobacillus spp. isolated from fresh feces of healthy people were identified to species level by traditional physiological and biochemical methods combined with molecular biological methods. The standard fingerprint of Lactobacillus spp. was constructed by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and the length of amplified fragments was used. The genetic polymorphism among different Lactobacillus strains was studied by AFLP technique, which laid a foundation for the development of lactic acid bacteria resources, the screening of probiotics and the development of intestinal microecological health products in China.
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R371

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6 李W毲，

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