【摘要】：目的用p IRES2-EGFP-Fc載體構(gòu)建重組人RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物12(MED12)-Fc真核表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞表達(dá)MED12-Fc融合蛋白,純化和鑒定MED12-Fc。方法根據(jù)Gen Bank中的序列信息,從基因組上擴(kuò)增出人MED12基因第2、3和4外顯子,并通過Overlap聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)拼接獲得目的基因片段,以p IRES2-EGFP-Fc真核表達(dá)質(zhì)粒為載體,構(gòu)建重組人MED12-Fc真核表達(dá)質(zhì)粒。使用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,48 h收集上清液,用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)鑒定質(zhì)粒的表達(dá)能力。表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)CHO細(xì)胞,通過G418抗性篩選及流式細(xì)胞儀熒光篩選,獲得高表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株。使用穩(wěn)定細(xì)胞株培養(yǎng)表達(dá)人MED12-Fc融合蛋白,收集上清液,用Proein A親和純化柱純化蛋白。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)檢測蛋白質(zhì)分子量。結(jié)果通過DNA測序和瞬時轉(zhuǎn)染表達(dá)鑒定,證實MED12第2、3和4外顯子基因序列正確,成功獲得重組人MED12-Fc真核表達(dá)質(zhì)粒。通過電轉(zhuǎn)化、G418及流式細(xì)胞儀熒光篩選,獲得高表達(dá)重組人MED12-Fc的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。通過細(xì)胞培養(yǎng),親和層析純化,獲得高純度的重組人MED12-Fc融合蛋白。結(jié)論成功構(gòu)建MED12-Fc融合蛋白的表達(dá)載體,獲得高純度的重組人MED12-Fc融合蛋白,為進(jìn)一步研究MED12蛋白功能奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective to construct recombinant human RNA polymerase 鈪，

本文編號：2205681