【摘要】： 肺炎衣原體是一類嚴(yán)格的活細(xì)胞內(nèi)寄生的、具有獨(dú)特生活周期的微生物。其復(fù)制和生物合成是在被感染的宿主細(xì)胞內(nèi)形成的包涵體中進(jìn)行的,因此包涵體是衣原體賴以生存和繁殖的微環(huán)境,為了建立和維持衣原體在感染細(xì)胞包涵體內(nèi)的生長(zhǎng),就必須通過包涵體膜與宿主細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)和信號(hào)的交換。自從1995年Rochey等用實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)衣原體通過自身表達(dá)的蛋白而主動(dòng)修飾包涵體膜以來,陸續(xù)有新的包涵體膜蛋白被鑒定出來,并對(duì)部分包涵體膜蛋白的生物學(xué)作用進(jìn)行了研究,初步顯示包涵體膜蛋白參與與宿主間的相互作用及其致病性。 由于包涵體膜蛋白在研究衣原體中發(fā)育以及致病過程中的重要地位,尋找并探究包涵體膜蛋白的生物學(xué)作用成為研究的熱點(diǎn)之一。根據(jù)已經(jīng)鑒定的膜蛋白的疏水性特征,計(jì)算機(jī)輔助程序預(yù)測(cè)出90個(gè)肺炎衣原體(CPn)基因編碼的蛋白為候選包涵體膜蛋白,但目前通過直接抗體標(biāo)記檢測(cè)證實(shí)的包涵體膜蛋白為數(shù)不多。已有的發(fā)現(xiàn)提示并非所有計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)的包涵體膜蛋白均位于包涵體膜上。因此使用試驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)假定的包涵體膜蛋白并進(jìn)一步探討其特性對(duì)深入了解衣原體的生物學(xué)作用、致病性以及預(yù)防具有重要意義。 CPn0308是預(yù)測(cè)的包涵體膜蛋白,是否定位于包涵體膜上尚有待于進(jìn)一步確認(rèn)。為此本研究在檢索CPn基因庫信息的基礎(chǔ)上,分析CPn0308及其相關(guān)基因的特性;克隆CPn0308及其相關(guān)基因并表達(dá)其GST融合蛋白;制備多克隆和單克隆抗體,對(duì)內(nèi)源性蛋白的表達(dá)進(jìn)行定位;在定位的基礎(chǔ)上對(duì)其特性進(jìn)一步研究,以期為更全面了解衣原體包涵體膜蛋白的生物學(xué)作用提供信息。 第一部分CPn0308及其相關(guān)基因的克隆與表達(dá) 目的:分析和克隆CPn0308和與其相關(guān)的其他衣原體基因(包括CT249、MoPn052和GPIC0474)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步表達(dá)相關(guān)的蛋白,為后續(xù)制備抗體、鑒定包涵體膜蛋白奠定基礎(chǔ)。 方法:①依據(jù)文獻(xiàn)提供的信息,檢索CPn0308信息,根據(jù)檢索提示,進(jìn)行相關(guān)分析。②選擇肺炎衣原體CPn0308基因的開放讀碼框架區(qū)的基因和相關(guān)基因CT249、MoPn0520、GPIC0474以及所用的克隆和表達(dá)載體pGEX-6P2設(shè)計(jì)引物;采用PCR方法獲取目的基因。③采用常規(guī)的酚-氯仿法提純擴(kuò)增的目的基因,進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切處理。④用T4連接酶連接純化后的消化產(chǎn)物與預(yù)處理的pGEX-6P2載體,然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞XL1-blue,接種在含有100μg/ml AMP的選擇性培養(yǎng)基LB平板上,37℃過夜培養(yǎng)。⑤采用針對(duì)pGEX-6P2載體的PCR初步篩選選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的克隆;對(duì)PCR擴(kuò)增陽性的克隆提取質(zhì)粒,進(jìn)一步采用交叉-PCR進(jìn)行鑒定;交叉PCR擴(kuò)增陽性的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序并進(jìn)行序列分析。⑥用IPTG誘導(dǎo)序列正確的克隆表達(dá)GST重組蛋白,用Glutathione Sepharose TM 4B純化重組蛋白,SDS-PAGE凝膠電泳鑒定。 結(jié)果:①CPn0308基因長(zhǎng)度為366bps,編碼121個(gè)氨基酸殘基,分子量為12.971kDa。CT249、GPIC0474和MoPn0520在基因結(jié)構(gòu)與CPn0308具有相似性。一個(gè)基因獨(dú)自為一個(gè)基因群,兩側(cè)均為已知的基因glgP和dnaA,編碼的氨基酸殘基數(shù)相似。②獲得了載體重組質(zhì)粒pGEX-6P2/CPn0308、pGEX-6P2/CT249、pGEX-6P2/MoPn0520和pGEX-6P2 /GPIC0474。經(jīng)過用針對(duì)pGEX-6P2載體的引物初步篩選后進(jìn)一步提取重組質(zhì)粒,經(jīng)過pGEX-6P2的引物和特異性引物進(jìn)行交叉PCR擴(kuò)增,獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期結(jié)果一致。直接以重組質(zhì)粒pGEX-6P2/CPn0308、pGEX- 6P2/CT249、pGEX-6P2/MoPn0520和pGEX-6P2/GPIC0474為模板進(jìn)行測(cè)序,得到克隆片段的DNA序列,與基因庫中的序列比對(duì)的一致性均為100%,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)均含有兩個(gè)跨膜區(qū)域。③選取陽性克隆誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白,經(jīng)過純化后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,顯示條帶與預(yù)期結(jié)果一致。 結(jié)論:①CPn0308及其相關(guān)的CT249、MoPn0520以及GPIC 0474基因結(jié)構(gòu)相似。②成功地將CPn0308以及CT249、MoPn0520和GPIC0474克隆到pGEX-6P2載體中,并表達(dá)出GST-CPn0308等四個(gè)GST融合蛋白。 第二部分CPn0308、CT249、MoPn0520和GPIC0474抗體制備及應(yīng)用 目的:本研究在第一部分克隆、表達(dá)蛋白基礎(chǔ)上進(jìn)一步制備CPn0308及其相關(guān)蛋白的多克隆抗體以及CPn0308的單克隆抗體;采用抗體標(biāo)記檢測(cè)法對(duì)四種內(nèi)源性蛋白進(jìn)行初步定位分析,以期為深入探究這些假定蛋白的生物學(xué)作用奠定基礎(chǔ)。 方法:①用Glutathione Sepharose TM 4B純化融合蛋白GST-CPn 0308、GST-CT249、GST-MoPn0520和GST-GPIC0474作為免疫原,常規(guī)方法免疫Balb/C小鼠,分離血清獲得多克隆抗體。對(duì)GST-CPn0308蛋白,常規(guī)方法制備單克隆抗體。②采用IFA進(jìn)行篩選陽性克隆和效價(jià)滴定。③用IFA方法對(duì)所獲取的單克隆抗體進(jìn)行類別的鑒定;應(yīng)用Western Blotting技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)抗體所識(shí)別的CPn0308的部位特異性和識(shí)別部位的鑒定。④用所制備的抗體進(jìn)行不同組合的IFA對(duì)四種抗體所對(duì)應(yīng)的內(nèi)源性蛋白進(jìn)行初步定位。進(jìn)一步用吸附試驗(yàn)和抗GST-CPn0308的多克隆抗體直接對(duì)四個(gè)不同種屬的衣原體(AR39、L2、MoPn和GPIC)感染后的HeLa細(xì)胞進(jìn)行IFA分析CPn0308與其他三個(gè)蛋白的同源性。 結(jié)果:①IFA測(cè)試血清的效價(jià)如下:CPn0308、MoPn0520、CT249和GPIC0474分別為1:2000、1:200、1:2000和1:200。②制備CPn0308的單克隆抗體獲得四株陽性雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為2D7、3A6、3H5、5E10;單克隆抗體均為IgG類抗體,其中2D7為IgG3亞類、3A6為IgG1亞類、3H5和5E10均為IgG2b亞類;四株單克隆抗體識(shí)別CPn0308的部位均為CPn0308N,即靠近氨基端一側(cè)。③IFA結(jié)果顯示假定衣原體蛋白CPn0308、CT249和MoPn0520位于包涵體膜上,即包涵體膜蛋白,而GPIC0474則不位于包涵體膜上。④與對(duì)照比較,用GST-CPn0308蛋白吸附GST-CPn0308的抗體未見包涵體膜蛋白的染色,而用GST-CT249、GST-MoPn0520和GST-GPIC0474吸附后仍然可見GST-CPn0308的抗體的特異性包涵體膜蛋白的染色。用GST-CPn0308的多克隆抗體直接對(duì)不同種屬的衣原體感染的HeLa進(jìn)行抗體染色,GST-CPn0308的多克隆抗體只識(shí)別AR39感染所形成的包涵體膜蛋白,而不識(shí)別其他三種衣原體感染所形成的包涵體膜及其包涵體內(nèi)的衣原體。 結(jié)論:①成功制備出四株CPn0308的單克隆抗體(2D7、3A6、3H5和5E10),均為IgG類,識(shí)別CPn0308的氨基端。②用多克隆抗體對(duì)相應(yīng)的蛋白進(jìn)行定位,假定蛋白CPn0308、CT249、MoPn0520位于各自衣原體感染HeLa細(xì)胞形成的包涵體膜上,而假定蛋白GPIC0474則不在包涵體膜上。③試驗(yàn)證實(shí)CPn0308與CT249、MoPn0520以及GPIC0474沒有同源性。 第三部分假定蛋白CPn0308特性的初步研究 目的:使用抗體標(biāo)記技術(shù)對(duì)假定蛋白CPn0308進(jìn)行鑒定,并對(duì)其特性進(jìn)行初步研究。 方法:①用含有R12AR39和CPn0308的多克隆抗體或單克隆抗體作一抗進(jìn)行IFA,在熒光顯微鏡下觀察假定蛋白CPn0308在感染細(xì)胞內(nèi)的初步定位。②選用已經(jīng)鑒定的CPn蛋白CPAFcp、IncA、MOMP和HSP60分別與CPn0308進(jìn)行共染色。在激光共聚焦顯微鏡下觀察目的蛋白CPn0308與其他參照蛋白的定位情況。③使用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染重組體pDsRed-C1/CPn0308和pDsRed-C1/CPn0186到HeLa細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察CPn0308抗體的染色特性;通過吸附試驗(yàn)觀察CPn0308抗體和IncA抗體對(duì)包涵體膜蛋白染色的特異性;采用Western Blotting技術(shù)檢測(cè)CPn0308抗體結(jié)合內(nèi)源性以及外源性蛋白的特異性。④分別在AR39感染HeLa細(xì)胞后的不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行IFA實(shí)驗(yàn),觀察內(nèi)源性CPn0308蛋白的表達(dá)時(shí)相。 結(jié)果:①使用融合蛋白GST-CPn0308的多克隆抗體和單克隆抗體檢測(cè)目的蛋白顯示初步定位于包涵體膜上。②選擇CPn0308的單克隆抗體與參照蛋白CPAFcp、IncA、MOMP和HSP60進(jìn)行共染色,所檢測(cè)到信號(hào)表明CPn0308與CPAFcp、MOMP和HSP60沒有交叉現(xiàn)象,與IncA有重疊現(xiàn)象,均位于細(xì)胞膜上,重疊部分的顏色為黃色。進(jìn)一步使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)CPn0308在包涵體膜上的定位,發(fā)現(xiàn)CPn0308的存在模式明顯不同于CPAFcp、MOMP和HSP60的模式,染色結(jié)果顯示綠、紅、藍(lán)三種顏色。但與IncA有重疊現(xiàn)象,顏色顯示為藍(lán)、黃兩種顏色。即使從Z軸不同的聚焦點(diǎn)觀察,均有與IncA重疊現(xiàn)象。③當(dāng)用針對(duì)CPn0308的多克隆抗體和單克隆抗體對(duì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)顯示,pDsRed-C1- CPn0308轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白染色為黃色,而pDsRed-C1-CPn 0186轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白染色為紅色;當(dāng)用針對(duì)CPn0186的單克隆抗體進(jìn)行染色時(shí),正好相反。與對(duì)照相比較,當(dāng)CPn0308的抗體用GST-CPn0308預(yù)吸附后染色可見抗體檢測(cè)信號(hào)消失,而用GST-CPn0186預(yù)吸附后染色仍然可見;當(dāng)CPn0186的抗體用GST-CPn0308預(yù)吸附后染色可見檢測(cè)信號(hào),用GST-CPn0186預(yù)吸附后信號(hào)消失。與參照抗體檢測(cè)信號(hào)相比,Western Blotting顯示用CPn0308的抗體只檢測(cè)到AR39感染后的HeLa細(xì)胞的裂解液和GST-CPn0308有相應(yīng)的蛋白條帶,而其他泳道沒有可檢測(cè)到的蛋白條帶。以上從三個(gè)不同的方面證實(shí)抗體結(jié)合包涵體膜的特異性。④在AR39感染后的不同時(shí)間點(diǎn),進(jìn)行IFA觀察顯示在感染后24h可明顯觀察到內(nèi)源性的CPn0308蛋白表達(dá)在包涵體的膜上,并且 在整個(gè)感染期間一直存在包涵體膜上。結(jié)論:①用CPn0308的多克隆抗體和單克隆抗體首次試驗(yàn)證實(shí)假定蛋白CPn0308位于CPn感染HeLa細(xì)胞形成的包涵體膜上。②共定位發(fā)現(xiàn)CPn 0308在包涵體上分布模式類似于IncA,而不同于參照蛋白CPAFcp、MOMP和HSP60。③CPn0308的表達(dá)時(shí)相為在感染后24h表達(dá)于包涵體膜上,并在后續(xù)的感染期間一直存在包涵體膜上。 第四部分感染肺炎衣原體人群中CPn0308免疫原性的檢測(cè)分析目的:在分析缺血性腦血管疾病(ICVD)患者肺炎衣原體感染的基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析CPn0308的免疫原性。 方法:①收集相關(guān)的臨床標(biāo)本,分離血漿和提取外周血中單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中的DNA。②用肺炎衣原體的IgG和IgM診斷試劑盒檢測(cè)血漿中肺炎衣原體的感染情況。③用PCR法檢測(cè)分析外周血單個(gè)核細(xì)胞中肺炎衣原體DNA的存在情況。④用Western Blotting法分析內(nèi)源性蛋白CPn0308的免疫原性。 結(jié)果:①在所檢測(cè)的70例ICVD標(biāo)本中,IgG的陽性率為51.43%,與對(duì)照比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;IgM的陽性率2.86%;與對(duì)照比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②ICVD患者CPn DNA的陽性率為81.08%,顯著高于對(duì)照組。③當(dāng)血漿標(biāo)本按1:500稀釋后,仍可檢測(cè)到CPn0308的抗體。當(dāng)用結(jié)合GST-CPn 0308的凝膠微粒(Beads)預(yù)吸附可中斷反應(yīng),而用GST-CPn0186 Beads預(yù)吸附則不能中斷反應(yīng),說明反應(yīng)的特異性。 結(jié)論:①ICVD患者CPn IgG的陽性率明顯升高。②ICVD患者PBMC中CPnDNA陽性率顯著升高;檢出率高于EIA法,是一種敏感的檢測(cè)CPn感染的檢測(cè)方法。③初步分析顯示CPn0308在感染人群中具有一定的免疫原性。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R374

【參考文獻(xiàn)】

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1 賈天軍,李萍,張庶民,張印則,張寅龍,雷殿良;MBL EXON Ⅰ 54位基因突變檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2003年06期

2 ;各類腦血管疾病診斷要點(diǎn)[J];中華神經(jīng)科雜志;1996年06期

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本文編號(hào)：2202985