【摘要】： 目的:探討兩種糖基轉移酶(ppGalNAcT2及β3GnT8)對膠質瘤細胞U251侵襲轉移的影響。 方法:(1)將ppGalNAcT2及β3GnT8的真核表達正義載體及空載體、RNA干擾載體及其對照載體通過脂質體轉染入膠質瘤細胞U251,并通過G418篩選出穩(wěn)定細胞株。(2)熒光顯微鏡觀察轉入熒光載體的細胞株,RT-PCR檢測ppGalNAcT2的表達;流式細胞術及MTT檢測ppGalNAcT2對細胞周期及增殖的影響;劃痕修復實驗檢測各組細胞的遷移能力差異;采用RT-PCR方法檢測各組細胞MMP-2、TIMP-2 mRNA水平表達變化。(3)通過激光共聚焦顯微鏡觀察檢測GFP蛋白和β3GnT8的蛋白表達;RT-PCR及western blotting方法檢測細胞β3GnT8 mRNA及蛋白水平表達變化;集落形成實驗檢測β3GnT8對單細胞形成集落能力的影響;劃痕修復實驗及Boyden小室檢測細胞遷移及侵襲能力差異;采用RT-PCR及western blotting方法檢測各組細胞MMP-2、TIMP-2 mRNA及蛋白水平表達變化。 結果:(1)通過熒光顯微鏡觀察、RT-PCR、western blotting及免疫熒光檢測,載體成功轉入細胞,得到穩(wěn)定轉染細胞株;(2)流式細胞術及MTT實驗檢測發(fā)現(xiàn)ppGalNAc-T2與細胞的周期時相及增殖能力間不存在顯著相關性;劃痕結果顯示,ppGalNAc-T2上調組細胞遷移能力隨ppGalNAc-T2的上調而減弱,干擾組劃痕修復較快,其他對照組相近;RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)隨著ppGalNAc-T2的增高,MMP-2降低,而TIMP-2升高;(3)集落形成實驗顯示:與對照組相比,β3GnT8上調組單個細胞集落形成能力強,干擾組弱;劃痕結果顯示,β3GnT8上調組細胞遷移能力增強,而干擾組細胞劃痕修復較慢。與劃痕結果相對應的,通過Boyden小室實驗發(fā)現(xiàn),與對照組相比,β3GnT8上調組細胞的穿膜能力增強,細胞侵襲能力較強,而下調組穿膜率較對照組都低,侵襲能力弱;RT-PCR及western blotting檢測發(fā)現(xiàn)隨著β3GnT8表達的增高,MMP-2在mRNA水平及蛋白水平也相應升高,而TIMP-2表達水平未有顯著改變。 結論:(1)成功構建ppGalNAc-T2及β3GnT8上調及下調細胞株。(2)通過流式細胞術及MTT實驗檢測發(fā)現(xiàn),ppGalNAc-T2與細胞周期及增殖能力間無顯著相關性;劃痕實驗顯示ppGalNAc-T2抑制細胞的劃痕修復;進一步通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),ppGalNAc-T2與MMP-2呈負相關,與TIMP-2呈正相關。(3)細胞集落形成實驗顯示β3GnT8能促進集落形成;劃痕修復及Boyden侵襲小室實驗發(fā)現(xiàn),β3GnT8促進細胞的劃痕修復,同時促進細胞侵襲;進一步通過RT-PCR及western blotting檢測顯示,β3GnT8與MMP-2呈正相關,而與TIMP-2間無統(tǒng)計學意義。 綜上所述,我們推測這兩種糖基轉移酶ppGalNAc-T2及β3GnT8可能與膠質細胞的侵襲轉移密切相關。
[Abstract]:Aim: to investigate the effects of two glycosyltransferases (ppGalNAcT2 and 尾 3GnT8) on the invasion and metastasis of glioma cell U251. Methods: (1) ppGalNAcT2 and 尾 3GnT8 were transfected into glioma cell line U251 by liposome, and stable cell lines were screened by G418. (2) fluorescence microscope was used to observe the transfer into fluorescent carrier. The expression of ppGalNAcT2 was detected by RT-PCR. Flow cytometry and MTT were used to detect the effect of ppGalNAcT2 on cell cycle and proliferation. The expression of MMP-2 and TIMP-2 mRNA was detected by RT-PCR method. (3) the expression of GFP protein and 尾 3GnT8 protein was detected by laser confocal microscopy, and the expression of 尾 3GnT8 mRNA and protein was detected by western blotting method. Colony formation assay was used to detect the effect of 尾 3GnT8 on the colony forming ability of single cell, the difference of cell migration and invasion ability was detected by scratch repair test and Boyden chamber, and the expression of MMP-2TIMP-2 mRNA and protein were detected by RT-PCR and western blotting methods. Results: (1) RT-PCR blotting and immunofluorescence were observed by fluorescence microscope, and the vector was successfully transferred into cells. (2) flow cytometry and MTT assay showed that there was no significant correlation between ppGalNAc-T2 and cell cycle phase and proliferative ability, and the result of scratch showed that the migration ability of PG-GalNAc-T2 up-regulated cells decreased with the up-regulation of ppGalNAc-T2. The results of RT-PCR showed that MMP-2 decreased with the increase of ppGalNAc-T2, while TIMP-2 increased. (3) compared with the control group, 尾 3GnT8 upregulated the ability of single cell colony formation was stronger than that of the control group, but the interference group was weak. The results of scratch showed that the cell migration ability of 尾 3GnT8 upregulated group was enhanced, while that of interference group was slower. In contrast to the scratch results, Boyden chamber experiments showed that the cells in 尾 3GnT8 upregulated group had stronger membrane penetration and more invasive ability than those in the control group, but the membrane penetration rate in the down-regulated group was lower than that in the control group. RT-PCR and western blotting analysis showed that the expression of MMP-2 increased with the increase of 尾 3GnT8 expression in mRNA and protein level, but the expression of TIMP-2 did not change significantly. Conclusion: (1) ppGalNAc-T2 and 尾 3GnT8 up-regulated and down-regulated cell lines were successfully constructed. (2) ppGalNAc-T2 GalNAc-T2 was not significantly correlated with cell cycle and proliferation ability by flow cytometry and MTT assay, and scratch test showed that ppGalNAc-T2 inhibited cell scratch repair. Furthermore, the results of RT-PCR detection showed that MMP-2 was negatively correlated with MMP-2, and positively correlated with TIMP-2. (3) Cell colony formation assay showed that 尾 3GnT8 could promote colony formation, and that 尾 3GnT8 promoted cell scratch repair and Boyden invasion chamber experiment, and 尾 3GnT8 promoted cell scratch repair. Furthermore, RT-PCR and western blotting showed that 尾 3GnT8 was positively correlated with MMP-2, but had no statistical significance with TIMP-2. In conclusion, we speculate that these two glycosyltransferases ppGalNAc-T2 and 尾 3GnT8 may be closely related to the invasion and metastasis of glial cells.
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R739.41;R341

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