【摘要】： 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一種革蘭氏陰性、螺桿狀的微需氧菌,定植于人胃粘膜上皮細胞,可導致慢性胃炎、消化性潰瘍,胃粘膜相關淋巴組織(MALT)淋巴瘤及胃癌的發(fā)生,1994年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(IARC)已將其列為Ⅰ類致癌因子。幽門螺桿菌在定植胃粘膜后可以激活人體免疫系統(tǒng),包括局部性和全身性抗體反應、細胞介導的免疫反應等。臨床資料及動物實驗表明這些先天性和繼發(fā)性免疫反應對幽門螺桿菌具有一定的清除能力,如果能夠充分地理解它們對幽門螺桿菌的免疫殺傷作用,就可以為新型抗幽門螺桿菌制劑的開發(fā)提供重要線索。 一氧化氮(nitric oxide,NO)分子是具有抗菌作用和免疫調節(jié)活性的重要的效應分子,它的L-精氨酸合成途徑有賴于一氧化氮合酶(NOS)的催化作用,機體內的NOS有結構型一氧化氮合酶(cNOS)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)兩類。其中,在感染、炎癥以及一些生理狀態(tài)下,iNOS可表達于多種細胞。當iNOS表達后,能持續(xù)生成大量的NO,在機體的免疫過程中,尤其是抗感染免疫中發(fā)揮重要的作用。因此,NO是當今生物學和醫(yī)學領域中比較熱門的研究課題之一,在微生物學領域,NO的研究也十分活躍。 眾所周知,半胱氨酸(含巰基,結構式為HS-)在多種蛋白功能中發(fā)揮重要作用。NO與巰基之間形成共價鍵的過程被稱為巰基亞硝基化修飾。這種修飾與多種生理和病理過程密切相關,例如平滑肌舒張、神經遞質傳遞和免疫防御等。目前比較常用的分析巰基亞硝基化蛋白質特征的方法是生物素轉換法,并借助抗體法或質譜技術來進一步研究發(fā)生巰基亞硝基化的蛋白質。將活性巰基進行亞硝基化修飾是NO損傷病原體的重要機制,因此,針對巰基亞硝基化的分析方法非常適合研究免疫分子NO對微生物的作用靶點。 基因組學和蛋白質組學技術都是整體的高通量的生物技術體系,它們的興起推動了生命科學各個分支突飛猛進的發(fā)展。基因是遺傳信息的攜帶者,蛋白質才是全部生物功能的執(zhí)行者,由于轉錄后調控和翻譯的影響,mRNA水平的變化不能完全反映蛋白質豐度的變化。而蛋白質組學是在整體水平上高通量地對不同時間和空間發(fā)揮功能的特定蛋白質群體進行研究的技術體系,已被證實是研究細菌應對各種環(huán)境壓力的適應反應的有力工具。幽門螺桿菌的兩個菌株(H.pylori26695和H.pyloriJ99)的全基因組序列已經測序完成,為了充分利用這些生物信息學資源,本研究應用生物素轉換法和高通量的比較蛋白質組學方法分析了NO對幽門螺桿菌蛋白質的巰基亞硝基化修飾和幽門螺桿菌在NO壓力下的蛋白質表達的變化情況,旨在發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌抗逆生存的新機制。該課題主要研究內容及實驗結果如下: 一、一氧化氮對幽門螺桿菌菌體蛋白巰基亞硝基化修飾及其抑菌作用 當幽門螺桿菌感染人體后,它可以激活宿主的先天性和繼發(fā)性免疫反應,其中,NO是一種重要的非特異性免疫效應分子,目前尚無研究分析NO等活性氮類物質(RNS)對幽門螺桿菌的抑菌活性,而RNS對抗病原微生物的一個主要的作用機制是將重要生命蛋白的活性半胱氨酸氧化和亞硝基化,使菌體蛋白功能弱化或丟失。然而,RNS對幽門螺桿菌的靶蛋白尚不清楚。本實驗首次在體外實驗檢測了NO對幽門螺桿菌的較強的抑菌和殺菌活性,分析了幽門螺桿菌在應用NO供體GSNO處理后蛋白質發(fā)生巰基亞硝基化的情況。即將幽門螺桿菌的菌體蛋白質與GSNO孵育后,用生物素轉換法(BSM)標記發(fā)生巰基亞硝基化的蛋白,然后再進行純化、凝膠電泳分離,最后對巰基亞硝基化蛋白進行MALDI-TOF-TOF質譜鑒定。明確地鑒定了五種發(fā)生巰基亞硝基化的蛋白質,分別為:伴侶分子及熱休克蛋白(GroEL)、尿素酶α亞基(UreA)、烷基氫過氧化物還原酶(TsaA)、HP0721和HP0129,這初步揭示了RNS對幽門螺桿菌的可能的抑菌機制:通過對蛋白質的巰基亞硝基化修飾靶定、抑制細菌的抗氧化防御功能以及粘附、定植能力等。 二、幽門螺桿菌在一氧化氮壓力下的蛋白質組反應特征 幽門螺桿菌具有多種策略逃逸先天性免疫反應,經由NOS途徑合成的NO等活性氮類物質是先天性免疫反應中的重要效應分子。然而,幽門螺桿菌如何在NO壓力下存活的機制至今尚未完全闡明。本實驗應用蛋白質組學的方法分析了幽門螺桿菌在亞硝基化壓力下的蛋白質反應特征。利用比較蛋白質組學的方法篩選到38個受NO供體(硝普鈉)調節(jié)的蛋白質。這些蛋白質分別參與蛋白質處理過程、抗氧化、一般性壓力反應、毒力因子以及一些未知功能等。值得注意的是在我們所篩選到的蛋白質中,一些蛋白質參與鐵代謝,綜合相關的文獻報道的結果,推測它們很可能處在高鐵攜帶調節(jié)元(Fur)的控制下。雖然可能由于受蛋白質低豐度的限制,在比較蛋白質組學中沒有捕獲到Fur蛋白,但實時定量PCR的結果表明亞硝基化壓力可以誘導Fur在轉錄水平的上調。此外,在38種壓力蛋白中,著重對硫氧還蛋白還原酶(TrxR)進行了分析。為了證實Fur或TrxR在幽門螺桿菌耐受NO壓力中的作用,我們構建了Fur和TrxR的基因缺失突變株,經檢測fur或trxR基因缺失突變后幽門螺桿菌對亞硝基化壓力更加敏感,這表明Fur調節(jié)元和TrxR在NO壓力調節(jié)中發(fā)揮重要的作用。
[Abstract]:Helicobacter pylori (H. pylori) is a gram-negative, screw-like microaerobic bacterium that colonizes human gastric epithelial cells and can cause chronic gastritis, peptic ulcer, gastric mucosa-associated lymphoid tissue (MALT) lymphoma and gastric cancer. It was listed by the International Agency for Research on Cancer (IARC) of the World Health Organization in 1994. Class I carcinogenic factors. Helicobacter pylori can activate the human immune system after colonization of gastric mucosa, including local and systemic antibody reactions, cell-mediated immune responses, etc. Clinical data and animal experiments show that these congenital and secondary immune reactions have certain clearance of Helicobacter pylori, if fully geographically Understanding their immuno-killing effect on Helicobacter pylori may provide important clues for the development of new anti-Helicobacter pylori agents.
Nitric oxide (NO) molecule is an important effector molecule with antimicrobial and immunoregulatory activities. Its L-arginine synthesis pathway depends on the catalysis of nitric oxide synthase (NOS). There are two types of NOS in the body: structural nitric oxide synthase (cNOS) and inducible nitric oxide synthase (iNOS). INOS can be expressed in many kinds of cells under some physiological conditions. When iNOS is expressed, it can continuously produce a large number of NO, which plays an important role in the immune process of the body, especially in anti-infective immunity. Therefore, NO is one of the hottest research topics in the field of biology and medicine. In the field of microbiology, the study of NO is also very active. Jump.
It is well known that cysteine (HS-) plays an important role in many protein functions. The formation of covalent bonds between NO and thiols is called mercaptonitrosation modification. This modification is closely related to a variety of physiological and pathological processes, such as smooth muscle relaxation, neurotransmitter delivery and immune defense. Biotin conversion method is used to analyze the characteristics of mercapto-nitroso proteins, and the mercapto-nitroso proteins are further studied by antibody or mass spectrometry. Nitroso modification of active mercapto is an important mechanism of NO damage to pathogens. Therefore, the analysis method for mercapto-nitroso is very suitable. Objective to study the target of immune molecule NO on microorganisms.
Genomics and proteomics are high-throughput biotechnology systems as a whole, and their rise has promoted the rapid development of various branches of life sciences. Genes are carriers of genetic information, and proteins are the executors of all biological functions. Due to the influence of post-transcriptional regulation and translation, changes in the level of mRNA can not be achieved. Proteomics is a high-throughput system for studying specific proteins that function in different time and space at an overall level. It has been proved to be a powerful tool for studying the adaptive responses of bacteria to various environmental stresses. Two strains of Helicobacter pylori (H. pylori 26) Genome-wide sequences of 695 and H. pylori J99 have been sequenced. In order to make full use of these bioinformatics resources, biotin conversion and high-throughput comparative proteomics methods were used to analyze the sulfhydryl nitroso modification of Helicobacter pylori protein by NO and the protein expression of Helicobacter pylori under NO pressure. The main research contents and experimental results are as follows:1.
Nitric oxide on thiol nitrosation of Helicobacter pylori and its bacteriostatic effect
When Helicobacter pylori infects humans, it can activate the innate and secondary immune responses of the host. NO is an important non-specific immune effector molecule. Up to now, no studies have been done to analyze the antibacterial activity of reactive nitrogen substances (RNS) such as NO against Helicobacter pylori. One of the main mechanisms of RNS against pathogenic microorganisms is that However, the target protein of RNS to Helicobacter pylori is still unclear. In this experiment, the strong bacteriostatic and bactericidal activity of NO to Helicobacter pylori was detected in vitro for the first time, and the effect of GSNO on Helicobacter pylori was analyzed. After incubation of Helicobacter pylori bacterial proteins with GSNO, the proteins labeled with biotin conversion method (BSM) were purified and separated by gel electrophoresis. Finally, the proteins were identified by MALDI-TOF-TOF mass spectrometry. Sulfhydryl nitrosogenic proteins are chaperone molecule and heat shock protein (GroEL), urease alpha subunit (UreA), alkyl hydroperoxide reductase (TsaA), HP0721 and HP0129, which preliminarily reveal the possible bacteriostatic mechanism of RNS to Helicobacter pylori. Defense function, adhesion and colonization ability.
Two, the proteome reaction characteristics of Helicobacter pylori under no pressure.
Helicobacter pylori has a variety of strategies to escape innate immune responses. Active nitrogen compounds, such as NO, synthesized via NOS pathway, are important effectors in innate immune responses. However, the mechanism of how Helicobacter pylori survives under NO pressure has not been fully elucidated. Proteomic analysis of Helicobacter pylori has been carried out in this study. Characteristics of bacterial protein reactions under nitrosation pressures. 38 proteins regulated by nitric oxide donors (sodium nitroprusside) were screened by comparative proteomics. These proteins are involved in protein processing, antioxidation, general stress response, virulence factors, and some unknown functions, respectively. Some of the selected proteins are involved in iron metabolism, and the results of the literature suggest that they may be under the control of iron-carrying regulator (Fur). Although Fur proteins may not be captured in comparative proteomics due to low protein abundance, the results of real-time quantitative PCR show that nitroso In addition, thioredoxin reductase (TrxR) was analyzed in 38 stress proteins. To confirm the role of Fur or TrxR in the tolerance of H. pylori to NO stress, we constructed mutants with deletion of Fur and TrxR genes, which were detected in pylorus after deletion of fur or trxR genes. Helicobacter spp. is more sensitive to nitrosation pressure, suggesting that Fur regulator and TrxR play an important role in NO pressure regulation.
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R378

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