【摘要】： 輪狀病毒(Rotavirus)屬于呼腸病毒科(Reoviridae)輪狀病毒屬(Rotavirus),是一個(gè)直徑約為70 nm、無(wú)包膜、具有三層衣殼的RNA病毒。1973年,RV被發(fā)現(xiàn)為引起嬰幼兒非細(xì)菌性腸胃炎的主要病原體。目前每年全球約有600,000兒童死于RV感染所導(dǎo)致的重癥腹瀉中。RV基因組包含11個(gè)分節(jié)段的雙鏈RNA,編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。根據(jù)結(jié)構(gòu)蛋白VP6的抗原性差異,可將輪狀病毒分為A-G 7個(gè)組,其中,A組為引起嬰幼兒腹瀉的主要病原。 A組RV非結(jié)構(gòu)蛋白NSP2一般由317個(gè)氨基酸組成,是一個(gè)大小約為35 KDa的堿性蛋白質(zhì),N末端和C末端由一個(gè)帶正電的25 A深的裂縫分開(kāi),里面含有能結(jié)合和水解NTPs的殘基。NSP2參與RV復(fù)制,它能與RV其它蛋白,如NSP5相互作用形成毒質(zhì)體。在毒質(zhì)體內(nèi),病毒基因組雙鏈RNA被復(fù)制并包裝進(jìn)入前病毒核心顆粒中。重組表達(dá)的NSP2也具有Mg~(2+)依賴(lài)性NTPase活性,能夠水解NTPs上的γ磷酸基團(tuán),起到NTP酶的作用。 為了深入了解NSP2的重組表達(dá)、亞細(xì)胞分布及其免疫學(xué)性質(zhì),本研究克隆了A組人RV TB-Chen株NSP2全基因,構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-NSP2,并在大腸桿菌BL21(DE3)中高效表達(dá)了重組蛋白NSP2(rNSP2)。研究結(jié)果表明,rNSP2表達(dá)量占菌體總蛋白量的44.54%。利用純化的rNSP2免疫豚鼠,能夠誘發(fā)豚鼠產(chǎn)生抗NSP2特異性血清抗體。Western blot和免疫熒光檢測(cè)表明所得抗體不僅能與該rNSP2蛋白發(fā)生特異性反應(yīng),而且可以與SA11株或Wa株RV感染的MA104細(xì)胞中表達(dá)的病毒NSP2發(fā)生反應(yīng)。研究結(jié)果還表明,在菌體細(xì)胞中表達(dá)的rNSP2以包涵體形式存在,充滿(mǎn)了整個(gè)菌體;SA11株或Wa株RV感染的MA104細(xì)胞中表達(dá)的病毒NSP2在病毒感染3h時(shí)就能檢測(cè)到,并且主要以毒質(zhì)體形式存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),在細(xì)胞核周?chē)忻芗植肌?以上研究結(jié)果為進(jìn)一步研究該NSP2蛋白的結(jié)構(gòu)、功能、免疫學(xué)性質(zhì)及其開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定了很好的基礎(chǔ)。
[Abstract]:Rotavirus (Rotavirus) belongs to the (Reoviridae) rotavirus genus (Rotavirus), of the family Reoviridae, which is a RNA virus with a diameter of about 70 nm, no capsule and three capsids. In 1973, RV was found to be the main pathogen causing non-bacterial gastroenteritis in infants and young children. At present, every year about 600000 children die of severe diarrhea caused by RV infection. The genome of .RV contains 11 segments of double-stranded RNAs, encoding 6 structural proteins and 6 non-structural proteins. According to the antigenicity difference of structural protein VP6, rotavirus can be divided into 7 groups. Group A is the main pathogen of infantile diarrhea. Group A RV non-structural protein NSP2 is composed of 317 amino acids. The N and C ends of a basic protein about 35 KDa in size are separated by a positively charged 25 A deep fissure, containing residues capable of binding and hydrolyzing NTPs. NSP2 is involved in RV replication, and it can interact with other RV proteins. For example, NSP5 interacts to form toxic plastids. In vivo, the viral genome double-stranded RNA is copied and packaged into the core particles of the virus. The recombinant NSP2 also has Mg2-dependent NTPase activity, which can hydrolyze 緯 -phosphate group on NTPs and play the role of NTP enzyme. In order to understand the recombinant expression, subcellular distribution and immunological properties of NSP2, the whole NSP2 gene of group A human RV TB-Chen strain was cloned, the recombinant expression plasmid pET-NSP2 was constructed, and the recombinant protein NSP2 (rNSP2) was highly expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The results showed that rNSP2 expression accounted for 44.54% of the total bacterial protein. Using purified rNSP2 to immunize guinea pigs, guinea pigs were induced to produce anti NSP2 specific serum antibody. Western blot and immunofluorescence assay showed that the obtained antibody could not only react specifically with the rNSP2 protein. Moreover, it can react with viral NSP2 expressed in MA104 cells infected with SA11 or WA strain RV. The results also showed that the rNSP2 expressed in bacterial cells existed in the form of inclusion bodies, and the viral NSP2 expressed in MA104 cells infected with SA11 or WA strain RV could be detected at 3 h after infection. And it mainly exists in cytoplasm in the form of toxic plastids, and has dense distribution around the nucleus. These results provide a good basis for the further study of the structure, function, immunological properties and development and application of the NSP2 protein.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R373

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本文編號(hào)：2182101