【摘要】： 樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)是主要的一種抗原遞呈細(xì)胞,目前認(rèn)為DC細(xì)胞抗原遞呈的方式有三種:一種是DC細(xì)胞吞噬外來抗原,并加工處理形成表位肽,與MHCⅡ類分子結(jié)合,從而激活CD4+T細(xì)胞;另外一種指DC細(xì)胞將內(nèi)源性合成的蛋白處理與MHCⅠ類分子結(jié)合激活CD8+T細(xì)胞;Bevan提出了一種新的DC細(xì)胞遞呈抗原的方式——交叉遞呈(cross presentation),它是指抗原遞呈細(xì)胞將外源性的抗原加工處理,負(fù)載到MHCⅠ類分子表面形成復(fù)合物,從而激活初始CD8+T細(xì)胞引起細(xì)胞免疫反應(yīng)的過程。交叉遞呈對(duì)于監(jiān)視組織中的腫瘤以及清除那些不能感染抗原遞呈細(xì)胞的病毒起著十分重要的作用。詳細(xì)了解DC細(xì)胞交叉遞呈的機(jī)制將有助于我們更好的找到抗腫瘤和抗病毒的途徑,為腫瘤和病毒感染的免疫治療提供新的線索。但是目前對(duì)于DC細(xì)胞交叉遞呈的調(diào)節(jié)機(jī)制研究甚少。 以往許多研究均表明Rho GTPase參與調(diào)節(jié)DC細(xì)胞生理活動(dòng)的許多方面,包括細(xì)胞形態(tài)的重塑,樹突的伸展,抗原的吞噬以及T細(xì)胞的活化。Cdc42和Rac1影響DC細(xì)胞對(duì)外來抗原的吞噬能力,其中Cdc42的活化對(duì)于DC細(xì)胞成熟過程中吞噬能力的變化起著重要作用;RhoB影響LPS刺激后DC細(xì)胞表面MHCⅡ分子的表達(dá);另外,Rac1抑制性突變體的轉(zhuǎn)基因小鼠DC細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞的能力下降,從而影響交叉遞呈。所以我們希望了解Rho家族蛋白在交叉遞呈中扮演什么樣的角色,是什么樣的機(jī)制參與其中? 目的:本研究希望通過一系列的實(shí)驗(yàn)篩選出對(duì)交叉遞呈有作用的Rho蛋白分子并進(jìn)一步探討可能的機(jī)制。 方法: 1、利用RNAi干擾的方法篩選常見的六種Rho分子:RNAi篩選的方法有利于我們將不同的分子進(jìn)行水平比較,并且為了解不同細(xì)胞的生物學(xué)功能提供線索。利用合成的siRNA,本研究分別干擾DC細(xì)胞中六種常見的Rho分子,然后利用T細(xì)胞雜交瘤B3Z檢測干擾后DC細(xì)胞交叉遞呈的能力;并且通過實(shí)時(shí)定量PCR的方法驗(yàn)證了RNA干擾的效率; 2、表達(dá)Rac2不同性質(zhì)突變體的DC細(xì)胞交叉遞呈能力分析:根據(jù)Rho分子的特性,活化型突變體和抑制型突變體常常作為研究Rho分子功能的有效手段。利用點(diǎn)突變的方法,本研究構(gòu)建了Rac2的兩種突變體——活化型突變體Rac2Q61L和抑制型突變體Rac2D57N,并且與黃色熒光蛋白EYFP融合表達(dá);通過慢病毒載體高效感染樹突狀細(xì)胞,得到穩(wěn)定表達(dá)EYFP-Rac2突變體的DC2.4,然后通過ELISA檢測表達(dá)不同突變體的DC細(xì)胞交叉遞呈的能力; 3、分子機(jī)制探討: (1)吞噬過程中Rac2的活化:熒光共振能量轉(zhuǎn)移(F?rster Resonance Energy Transfer, FRET)是目前研究兩蛋白分子之間相互作用的最有效的手段。相對(duì)于共聚焦顯微鏡,它不但表明兩分子之間空間距離的相近,更能從功能方面闡明兩分子之間的關(guān)系。由于Rac2活化后可以與下游的PAK分子相互作用,本研究利用慢病毒載體,將DC細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)染黃色熒光蛋白標(biāo)記的Rac2以及紅色熒光蛋白標(biāo)記的PAK分子,利用激光共聚焦顯微鏡觀察在吞噬外來抗原的過程中Rac2分子的活化情況以及在細(xì)胞中的定位; (2)吞噬實(shí)驗(yàn):利用表達(dá)不同Rac2突變體的DC細(xì)胞,觀察轉(zhuǎn)染不同突變體的DC細(xì)胞對(duì)外來的表達(dá)紅色熒光蛋白的細(xì)菌抗原在不同時(shí)相的吞噬能力,了解Rac2分子對(duì)吞噬功能的影響; (3)內(nèi)源性遞呈實(shí)驗(yàn):這種DC細(xì)胞可以內(nèi)源性表達(dá)OVA蛋白,有效地將表位肽與MHCⅠ類分子復(fù)合物遞呈到DC細(xì)胞表面,然后用表達(dá)EYFP-Rac2突變體的慢病毒感染DC-OVA細(xì)胞,觀察Rac2對(duì)DC-OVA細(xì)胞內(nèi)源性遞呈的影響,說明Rac2分子在DC細(xì)胞交叉遞呈中影響環(huán)節(jié); 4、Cd11c-EYFP-Rac2Q61L轉(zhuǎn)基因小鼠的建立:為了深入探討和觀察Rac2分子對(duì)DC細(xì)胞的功能影響,我們通過能在DC細(xì)胞中特異性表達(dá)EYFP-Rac2Q61L的慢病毒載體來感染小鼠胚胎細(xì)胞,得到了Cd11c-EYFP-Rac2Q61L轉(zhuǎn)基因小鼠,該實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的建立為我們研究交叉遞呈相關(guān)分子提供了有效的手段,從而便于我們可以從在體水平檢測該分子對(duì)交叉遞呈能力的影響。 結(jié)論:通過本研究,我們觀察到:(1)不同的Rho分子對(duì)DC細(xì)胞交叉遞呈的能力有所不同,干擾Rac2表達(dá)的DC細(xì)胞交叉遞呈能力明顯上升;(2)通過構(gòu)建慢病毒載體表達(dá)活化型和抑制型Rac2突變體,并將其轉(zhuǎn)染DC細(xì)胞,我們發(fā)現(xiàn)過度表達(dá)活化型突變體Rac2Q61L可以有效降低DC細(xì)胞的交叉遞呈;(3)在吞噬外來抗原的過程中,Rac2的活化發(fā)生在吞噬外來抗原的胞膜部分,活化下游PAK分子;(4)Rac2不影響DC細(xì)胞吞噬外來抗原的量以及內(nèi)源性遞呈。 可以初步得到結(jié)論:Rac2不同于其它的Rho分子,它負(fù)性調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞的交叉遞呈,并且Rac2的活化主要發(fā)生在胞膜周圍,通過與PAK分子的相互作用調(diào)節(jié)DC細(xì)胞的后續(xù)過程,可能與吞噬體的酸化,抗原降解有關(guān)而不是作用于交叉遞呈的其余階段。本研究為深入了解樹突狀細(xì)胞交叉遞呈的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ),而且這種負(fù)性調(diào)節(jié)分子Rac2的發(fā)現(xiàn)為了解疾病狀態(tài)下如腫瘤局部的免疫耐受提供了新的線索。
[Abstract]:Dendritic cells (DC) is one of the main antigen presenting cells. Currently, there are three types of antigen presenting DC cell antigens: one is that DC cells phagocytic external antigens, and processing and processing the epitope peptide to combine with MHC class II molecules to activate CD4+T cells; the other means that DC cells process endogenous synthetic proteins with M. HC class I molecules combine to activate CD8+T cells; Bevan has proposed a new way of DC cell presenting antigen, cross presentation (cross presentation), which refers to the processing of exogenous antigen by antigen presenting cells, which is loaded to the surface of MHC class I molecules to form complex, activating the initial CD8+T cells to cause cellular immune response. A detailed understanding of the mechanism of the cross delivery of DC cells will help us better find ways to resist cancer and antivirus, and provide new clues for the immunotherapy of cancer and disease. At present, there is little research on the regulation mechanism of DC cell cross delivery.
Many previous studies have shown that Rho GTPase participates in many aspects of regulating physiological activity of DC cells, including remodeling of cell morphology, extension of dendrites, phagocytosis of antigen, and the activation of T cells by.Cdc42 and Rac1 in the phagocytosis of DC cells to foreign antigens, in which the activation of Cdc42 plays a role in the change of phagocytosis in the process of DC cell maturation. RhoB affects the expression of MHC II molecules on the surface of DC cells after LPS stimulation; in addition, the ability of DC cells to phagocytic apoptotic cells in the Rac1 inhibited mutant mice decreases, thus affecting the cross presentation. So we want to know what role the Rho family protein plays in the cross presentation, and what kind of mechanism is involved. Among them?
OBJECTIVE: In this study, we hope to screen out the Rho protein molecule which has effect on cross-presentation through a series of experiments and further explore the possible mechanism.
Method:
1, using the RNAi interference method to screen six common Rho molecules: the RNAi screening method helps us to compare different molecules and provide clues for understanding the biological functions of different cells. Using synthetic siRNA, this study interferes with six common Rho molecules in DC cells, and then uses T cell hybridoma B3Z detection. The ability of DC cells to cross presentation was measured after interference, and the efficiency of RNA interference was verified by real-time quantitative PCR.
2, expressing the cross presenting ability of DC cells with different properties of Rac2: according to the characteristics of Rho molecules, active and inhibitory mutants are often used as an effective means to study the function of Rho molecules. By using point mutation methods, this study constructed two kinds of mutants of Rac2, active mutant Rac2Q61L and inhibition type mutation. The body Rac2D57N was fused with the yellow fluorescent protein EYFP, and the DC2.4 was expressed stably by the high efficient infection of the dendritic cells by the lentivirus vector, and then the ability to express the cross delivery of the DC cells with different mutants was detected by ELISA.
3, the discussion of molecular mechanism:
(1) activation of Rac2 during the phagocytosis: the fluorescence resonance energy transfer (F? Rster Resonance Energy Transfer, FRET) is the most effective means to study the interaction between the two protein molecules. Compared with confocal microscopy, it not only indicates the proximity of the spatial distance between the two molecules, but also clarifies the relationship between the two molecules from the functional aspect. Since Rac2 can interact with the downstream PAK molecules after activation, this study uses the lentivirus vector to simultaneously transfect the DC cells to the Rac2 labeled with the yellow fluorescent protein and the PAK molecules marked by the red fluorescent protein. The activation of the Rac2 molecules in the process of phagocytic antigen is observed by laser confocal microscopy and in the cell. Positioning;
(2) phagocytosis experiment: using DC cells expressing different Rac2 mutants to observe the phagocytic ability of DC cells transfected with different mutants to different phase, and to understand the effect of Rac2 molecules on phagocytosis.
(3) endogenous presentation experiment: the DC cells can express the OVA protein endogenous, effectively transfer the epitope and MHC class I complex to the DC cell surface, and then use the EYFP-Rac2 mutant of the lentivirus to infect the DC-OVA cells, and observe the effect of Rac2 on the endogenous recurrence of DC-OVA cells, indicating that the Rac2 molecules are in the cross delivery of DC cells. Influence link;
4, the establishment of Cd11c-EYFP-Rac2Q61L transgenic mice: in order to explore and observe the effect of Rac2 molecules on the function of DC cells, we infect mouse embryo cells by expressing EYFP-Rac2Q61L lentivirus vector specifically in DC cells, and obtained the Cd11c-EYFP-Rac2Q61L transgenic mice. The cross-presentation-related molecules provide an effective means for us to detect their effects on cross-presentation at the in vivo level.
Conclusion: through this study, we observed: (1) the ability of different Rho molecules to cross delivery of DC cells was different, and the cross delivery ability of DC cells that interfered with Rac2 expression increased obviously. (2) the expression of active and inhibitory Rac2 mutants by the construction of lentivirus vector and transfected to DC cells, we found overexpression of activation mutation. Body Rac2Q61L can effectively reduce the cross delivery of DC cells; (3) in the process of phagocytic antigen, the activation of Rac2 occurs in the membrane part of the external antigen, activating the downstream PAK molecule; (4) Rac2 does not affect the amount of the foreign antigen phagocytic and the endogenous delivery.
It can be concluded preliminarily that Rac2 is different from other Rho molecules, which negatively regulates the cross delivery of dendritic cells, and the activation of Rac2 mainly occurs around the cell membrane. Through the interaction with PAK molecules, the subsequent process of DC cells may be related to the acidification of the phagocytic, antigenic degradation, and not the rest of the DC cells. This study provides a basis for understanding the molecular mechanism of dendritic cells cross presenting, and the discovery of this negative regulatory molecule, Rac2, provides a new clue to understanding the local immune tolerance in the disease.
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2172219