【摘要】： 實驗目的在體外探討不同濃度IFN-α對人臍血來源DC分化成熟及功能的影響,對DC表面標志和功能進行檢測；同時進行肝癌細胞凍融抗原負載DC介導CTL對肝癌細胞殺傷實驗；評價該實驗方法培養(yǎng)DC的可行性及應用肝癌細胞凍融抗原負載DC介導的抗肝癌效應。 實驗方法從臍血中分離單個核細胞(CBMNC),在完全培養(yǎng)液(RPMI-1640+5%胎牛血清)中添加GM-CSF(1000U/ml)、IL-4(500U/ml)及不同濃度INF-a(A至E五組濃度為0、100、500、700、1000U/ml)聯(lián)合誘導CBMNC分化為DC,第7天收獲DC。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài),流式細胞儀測定DC表面標志CD14、CD83、CD86、CD40、CDla和HLA-DR的表達,MTT法測定DC對同種異體淋巴細胞的增殖能力和DC介導CTL對肝癌細胞的殺傷率,ELISA測定DC上清液中IL-12、IFN-y和IL-10細胞因子的含量。 實驗結果1.CBMNC在細胞因子GM-CSF+IL-4及不同濃度INF-a的共同作用下,培養(yǎng)3天大部分細胞仍貼壁生長,并可見部分細胞形成小的集落,未見明顯樹突狀樣突起；第7天可見細胞表面有明顯偽足樣突起,呈現(xiàn)典型的樹突狀形態(tài)。2.流式細胞儀分析表明第7天收獲的細胞高表達成熟DC的表面標志,其中本實驗第1部分的INF-a濃度為500 U/ml時的表達率(%)分別為CD86(95.10±1.53)、CD83(75.11±1.63)、CD1a(38.75±1.93)、HLA-DR(88.75±1.65)。3.在一定濃度范圍內(0、100、500、700U/ml), INF-a誘導培養(yǎng)的DC刺激異體淋巴細胞增殖反應呈遞增趨勢(P0.05),其中以INF-a濃度為700U/ml且T：DC=10：1時刺激異體淋巴細胞增殖的OD值最高(0.485±0.100),與其余組存在明顯統(tǒng)計學差異(P0.05)。4.本實驗中,INF-a濃度為700U/ml時,負載SMMC-7721抗原的DC誘導異體CTL對肝癌細胞的殺傷率(%)最高(30.1±1.6)；與其余組存在統(tǒng)計學差異(P0.05)。5. ELISA方法檢測A、B、C、D、E組第3天DC上清液細胞因子含量各組無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05)；第7天時各組的細胞因子含量均有升高,其中D組的IL-12(37.69±2.67 pg/ml)、IFN-y(49.94±1.35 pg/ml)含量最高,與其余各組存在統(tǒng)計學差異(P0.05)；而D組的IL-10(32.34±2.49 pg/ml)含量最低,與其余各組存在統(tǒng)計學差異(P0.05)。 實驗結論臍血分離的CBMNC在細胞因子GM-CSF, IL-4及不同濃度INF-a(0、100、500、700、1000U/ml)共同作用下在體外均可誘導分化成熟DC；不同濃度INF-a均能提高DC分泌的免疫刺激細胞因子IL-12、IFN-γ的能力,均能促進負載抗原的DC誘導的異體淋巴細胞增殖及提高DC介導CTL對肝癌的殺傷率。在本實驗中,INF-a濃度為700U/ml是誘導培養(yǎng)DC的最適濃度。本實驗將為DC應用于臨床提供一定的實驗基礎。
[Abstract]:Objective to investigate the effects of different concentrations of IFN- 偽 on the differentiation, maturation and function of DC derived from human umbilical cord blood, to detect the surface markers and function of DC, and to investigate the killing effect of DC mediated by CTL on hepatoma cells. To evaluate the feasibility of DC culture and the antitumor effect mediated by DC loaded with hepatoma cell freeze-thaw antigen. Methods Mononuclear cells (CBMNC),) isolated from umbilical cord blood were cultured in complete culture medium (RPMI-1640 5% fetal bovine serum) supplemented with GM-CSF (1000U/ml) IL-4 (500U/ml) and different concentrations of INF-a (A to E). CBMNC was induced to differentiate into DC1. The morphology of cells was observed under inverted microscope. Flow cytometry was used to detect the expression of CD14, CD83, CD86, CD40, CD40, CDla and HLA-DR on the surface of DC. The proliferative ability of DC to allogeneic lymphocytes and the killing rate of DC mediated CTL to hepatoma cells were determined by Elisa. The levels of IL-12, IFN-y and IL-10 cytokines in the supernatant of DC were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa). Results under the combined action of cytokine GM-CSF IL-4 and different concentrations of INF-a, most of the cells of 1.CBMNC were still adherent to the wall for 3 days, and some cells formed small colonies, but no dendritic processes were observed. On the 7th day, there were obvious pseudopodial protrusions on the surface of the cells, showing typical dendritic shape. 2. Flow cytometry (FCM) analysis showed that the cells harvested on the 7th day showed high expression of mature DC. The expression rates (%) of INF-a in the first part of the experiment were (95.10 鹵1.53) CD86 (75.11 鹵1.63) and (38.75 鹵1.93) HLA-DR (88.75 鹵1.65) .3, respectively. Within a certain concentration range (0100500700U/ml), the proliferation of allogeneic lymphocytes stimulated by DC induced by INF-a showed an increasing trend (P0.05), in which the OD value of allogeneic lymphocyte proliferation was the highest when the concentration of INF-a was 700U/ml and T:DC=10:1 was the highest (0.485 鹵0.100), compared with other groups. Significant statistical difference (P0.05). 4. In this experiment, when the concentration of INF-a was 700U/ml, DC loaded with SMMC-7721 antigen could induce the highest killing rate (30.1 鹵1.6) of allogeneic CTL to hepatoma cells, which was significantly different from other groups (P0.05). The levels of cytokines in the supernatant of DC were detected by ELISA on the 3rd day (P0.05), but on the 7th day, the levels of IL-12 (37.69 鹵2.67 pg/ml) and IFN-y (49.94 鹵1.35 pg/ml) in group D were significantly higher than those in other groups (P0.05). Group D had the lowest IL-10 content (32.34 鹵2.49 pg/ml), which was significantly different from other groups (P0.05). Conclusion CBMNC isolated from umbilical cord blood can induce differentiation and maturation of DC in vitro under the action of cytokines GM-CSF, IL-4 and different concentrations of INF-a, and different concentrations of INF-a can enhance the ability of IL-12 IFN- 緯 secreted by DCs. Both of them could promote the proliferation of allogeneic lymphocytes induced by DC loaded with antigen and increase the killing rate of CTL mediated by DC. In this experiment, the concentration of INF-a was 700U/ml, which was the best concentration for DC induction. This experiment will provide some experimental basis for the application of DC in clinic.
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392

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