本文選題：HSP10 + 腺病毒載體�。� 參考：《南京醫(yī)科大學(xué)》2009年碩士論文

【摘要】：目的:熱休克蛋白10(heat shock protein 10,HSP10)又稱CPN10、GROES或HSPE1,屬于小分子熱休克蛋白家族成員,主要作為一種分子伴侶蛋白,與HSP60協(xié)同,在蛋白質(zhì)折疊中發(fā)揮作用;HSP10還參與細胞周期調(diào)控、核質(zhì)運輸和新陳代謝。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),HSP10蛋白水平在多囊卵巢綜合征患者卵巢組織中的表達明顯低于正常人卵巢組織。但是,有關(guān)HSP10蛋白在多囊卵巢綜合征發(fā)生發(fā)展過程中的作用尚未有過報道。本研究通過構(gòu)建小鼠HSP10基因siRNA和超表達重組腺病毒載體及體外培養(yǎng)小鼠卵巢顆粒細胞,實現(xiàn)HSP10基因在小鼠卵巢顆粒細胞中的表達抑制和超表達;觀察改變HSP10基因表達后卵巢顆粒細胞的凋亡。通過該研究,探討HSP10在卵巢顆粒細胞中的生理功能,并為研究HSP10在多囊卵巢綜合征病理生理機制中的作用提供依據(jù)。 方法: (1)根據(jù)siRNA靶序列設(shè)計2條互補的64bp寡核苷酸,構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pShuttle-H1-siRNA,再與穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV進行連接,構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pATC-H1-siRNA。pATC-H1-siRNA經(jīng)酶切和測序鑒定后,通過“兩步轉(zhuǎn)化法”分別將腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1和穿梭質(zhì)粒pATC-H1-siRNA轉(zhuǎn)化至BJ-5183感受態(tài)細菌中進行同源重組得到AdCMV-H1-siRNA/HSP10重組腺病毒質(zhì)粒。繼而通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染AD-293細胞進行病毒包裝和擴增。AdCMV-H1-siRNA/HSP10轉(zhuǎn)染AD-293細胞收集的病毒上清,重復(fù)感染AD-293細胞四次,實現(xiàn)病毒大量擴增。(2)用RT-PCR的方法從小鼠卵巢組織中擴增HSP10基因全長,克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV上,構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pAdTrack-HSP10。分別將腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1和穿梭質(zhì)粒pAdTrack-HSP10轉(zhuǎn)化至BJ-5183感受態(tài)細菌中進行同源重組得到AdCMV-HSP10重組腺病毒質(zhì)粒。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染AD-293細胞進行病毒包裝和擴增。轉(zhuǎn)染后用收集的病毒上清重復(fù)感染細胞,實現(xiàn)病毒大量擴增。(3)每只標準克小鼠腹腔注射PMSG48小時后,取出雙側(cè)卵巢,獲得卵母細胞核卵丘細胞,加入透明質(zhì)酸酶消化使顆粒細胞與卵母細胞分離,以相同密度接種入6孔培養(yǎng)板,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。(4)將AdCMV-H1-siRNA/HSP10及AdCMV-HSP10重組腺病毒直接加入培養(yǎng)液中感染小鼠卵巢顆粒細胞。病毒感染小鼠卵巢顆粒細胞48小時后分別提取蛋白,通過Western blot的方法驗證HSP10在顆粒細胞中的表達抑制和超表達,應(yīng)用流式細胞術(shù)、TUNEL法檢測顆粒細胞的細胞凋亡。 結(jié)果: (1)穿梭質(zhì)粒pShuttle-H1-siRNA經(jīng)雙酶切與測序證實構(gòu)建成功,進一步與pAdTrack-CMV連接,構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pATC-H1-siRNA,構(gòu)建成功了HSP10基因的siRNA重組腺病毒質(zhì)粒pAdCMV-H1-siRNA/HSP10和對照質(zhì)粒pAdCMVH1-siRNA/control。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AD-293細胞后經(jīng)過包裝、擴增最終得到高滴度重組病毒,以GFP為標志測定AdCMV-H1-siRNA/HSP10病毒滴度為109 U/ml,AdCMVH1-siRNA/control病毒滴度為108 U/ml。(2)從小鼠卵巢組織中擴增出309bp的cDNA,測序證實為小鼠HSP10基因。在此基礎(chǔ)上,通過BJ-5183細菌內(nèi)同源重組的方法構(gòu)建了HSP10基因的重組腺病毒質(zhì)粒AdCMV-HSP10及對照質(zhì)粒AdCMV。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AD-293細胞后經(jīng)過包裝、擴增最終得到高滴度重組病毒,以GFP為標志測定AdCMV-HSP10病毒滴度為107 U/ml,AdCMV-GFP病毒滴度為108 U/ml。(3)成功進行了小鼠卵巢顆粒細胞的體外培養(yǎng),實現(xiàn)了HSP10在小鼠卵巢顆粒細胞內(nèi)表達抑制和超表達。與對照組相比,在HSP10表達抑制組中蛋白的表達水平明顯降低,兩組間差異顯著(p0.05)。同時,與對照組相比,在HSP10超表達組中蛋白的表達水平明顯升高,兩組間差異顯著(p0.05)。(4)用細胞流式術(shù)、TUNEL法檢測了HSP10表達抑制和超表達后顆粒細胞的細胞凋亡,結(jié)果顯示:與對照組相比,表達抑制組中細胞凋亡率明顯增加,兩組間差異顯著(p0.05);超表達后,顆粒細胞的細胞凋亡明顯減少,兩組間差異顯著(p0.05)。 結(jié)論:(1)小鼠HSP10基因siRNA和超表達重組腺病毒載體的構(gòu)建為進一步研究HSP10在PCOS發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制提供了實驗基礎(chǔ)。(2)HSP10在小鼠顆粒細胞內(nèi)表達抑制后明顯促進了細胞的凋亡;超表達后顆粒細胞的細胞凋亡明顯減少。表明HSP10與顆粒細胞凋亡的生理機制相關(guān)。(3)從課題組前期結(jié)果和本文結(jié)果推論,在PCOS發(fā)生發(fā)展中卵巢HSP10表達降低,進而誘導(dǎo)了顆粒細胞的凋亡。
[Abstract]:Objective : Heat shock protein 10 ( HSP10 ) , also known as CPN10 , GROES , or HSPE1 , is a member of small molecular heat shock protein family . It plays a role in protein folding . HSP10 plays a role in cell cycle regulation , nuclear transport and metabolism .

Methods : ( 1 ) The recombinant adenovirus vector of AdCMV - H1 - siRNA / HSP10 was cloned into BJ - 5183 competent bacteria . The recombinant adenovirus vector pAdTrack - H1 - siRNA / HSP10 was transformed into BJ - 5183 competent bacteria to obtain AdCMV - H1 - siRNA / HSP10 recombinant adenovirus plasmid . The recombinant adenovirus of AdCMV - H1 - siRNA / HSP10 and AdCMV - HSP10 was transfected into BJ - 5183 competent bacteria .

Results : ( 1 ) The recombinant plasmid pAdCMV - H1 - siRNA / HSP10 and control plasmid pAdCMVH1 - siRNA / control were constructed successfully . The recombinant plasmid pAdCMV - H1 - siRNA / HSP10 and control plasmid pAdCMVH1 - siRNA / control were constructed .

Conclusion : ( 1 ) The construction of HSP10 siRNA and overexpression recombinant adenovirus vector provides an experimental basis for further studying the role and mechanism of HSP10 in the development of PCOS .
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R363

【參考文獻】

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1 孫春玲;喬杰;陳英玉;張婷;胡振興;;體外受精-胚胎移植中多囊卵巢綜合征顆粒細胞凋亡與妊娠結(jié)局關(guān)系的探討[J];中國實用婦科與產(chǎn)科雜志;2007年09期

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本文編號：2093778