本文選題：促甲狀腺激素釋放激素 + 促甲狀腺激素釋放激素受體��； 參考：《第四軍醫(yī)大學》2008年博士論文

【摘要】： 背景與目的 促甲狀腺激素釋放激素(thyrotrophin-releasing hormone, TRH)最初是從羊和豬的下丘腦中提取并純化的3肽,它與垂體前葉促甲狀腺激素細胞表面特異性受體(thyrotrophin-releasing hormone receptors, TRHRs)結合,刺激促甲狀腺激素(TSH)的合成和分泌。在哺乳動物體內先后克隆出了針對TRH的兩個受體,TRH-R1和TRH-R2,兩者同屬G蛋白耦聯(lián)受體家族成員,在同種動物中其氨基酸序列具有50%的一致性。具有免疫活性的TRH及TRH受體不僅分布于下丘腦及其以外的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內,還廣泛存在于外周組織中。睪丸是外周組織中為數(shù)不多的可同時表達TRH及其兩個受體的器官,但TRH及其受體在睪丸內的功能尚不清楚,因而本實驗的目的在于探討TRHRs在大鼠睪丸內表達的意義。 研究方法和內容 1.利用蛋白質免疫印跡雜交及免疫組織化學方法對比研究出生后大鼠發(fā)育不同階段(8,14,21,35,60和90天)睪丸中TRH-R2和TRH-R1的表達和定位,并結合圖像分析技術對其表達進行半定量分析。 2.采用Percoll連續(xù)密度梯度法離心法提取、純化并原代培養(yǎng)成年大鼠(90天)睪丸Leydig細胞,探討不同劑量TRH對Leydig細胞睪酮合成的影響。 3.合成EDS,構建并驗證EDS誘導的Leydig細胞凋亡模型;采用Western blotting、免疫組織化學以及免疫熒光雙標的方法,觀察在EDS處理后成年型Leydig細胞再生過程中TRH-R1和TRH-R2的表達情況。 4.從出生后21d大鼠睪丸內分離、純化Leydig祖細胞,采用BrdU摻入實驗,觀察不同劑量的TRH對Leydig祖細胞DNA合成的影響。 結果 1.Western blotting和免疫組織化學均檢測到了TRH-R1和TRH-R2在大鼠睪丸出生后不同階段的表達,定位在Leydig細胞,陽性物質位于胞漿和胞膜,同一個Leydig細胞可同時表達TRH-R1和TRH-R2。圖像分析顯示兩者在不同階段Leydig細胞內的表達強度有所不同,TRH-R2最大表達量為出生后35d睪丸,主要為新形成及未成熟的Leydig細胞,而TRH-R1則在成年大鼠睪丸內表達較高,主要為成熟的Leydig細胞。 2.Percoll連續(xù)密度梯度離心法提取成年大鼠睪丸Leydig細胞,經(jīng)3β-HSD酶細胞化學染色,純度符合細胞學實驗要求。在給予不同劑量TRH處理后,原代培養(yǎng)的Leydig細胞睪酮分泌受到影響,并呈劑量依賴性。相對低劑量的TRH(0.01和0.1 ng/ml)可顯著抑制ALCs基礎睪酮和hCG刺激下的睪酮分泌,P值小于0.01;而相對高劑量的TRH(1和10 ng/ml)卻促進了hCG刺激下的睪酮分泌(P0.05)。雖然1 ng/ml TRH組與0.1 ng/ml TRH在基礎睪酮分泌上沒有統(tǒng)計學差異,1 ng/ml TRH刺激下,ALCs睪酮水平亦有所升高。 3.按照75mg/kg的劑量一次性給予大鼠腹腔注射EDS后,睪丸Leydig細胞在2 d后可全部凋亡消失,經(jīng)血清睪酮測量、睪丸恒冷箱切片3β-HSD酶細胞化學染色、石蠟切片HE染色以及3β-HSD的免疫組織化學染色等證實,動物模型復制成功。一次性腹腔注射EDS后,Leydig細胞在24hr內即發(fā)生退化,2-3天后,Leydig細胞全部消失。EDS處理后14d,在間質管周區(qū)出現(xiàn)長梭形Leydig細胞的再生,至處理后28d新生的Leydig細胞數(shù)量增加并由管周向間質中央遷移,變?yōu)槎嘟切巍?在EDS處理后的14d,Western blotting和免疫組織化學染色檢測到了TRH-R1和TRH-R2在睪丸內的表達,此時對應著大鼠睪丸Leydig祖細胞的再生,經(jīng)利用熒光雙標進一步證實,TRH-R1和TRH-R2陽性細胞即為再生的Leydig細胞。 4.采用Percoll連續(xù)密度梯度離心法從出生后14d大鼠中成功分離、純化了Leydig祖細胞。在給予不同劑量的TRH(0.001-10 ng/ml)并向培養(yǎng)液中添加10μM BrdU后,PLCs的DNA合成可受到TRH的影響。在孵育12小時后,相對低劑量的TRH(0.001-0.1 ng/ml)可增加BrdU陽性標記細胞的數(shù)量和比例(從8.2%升高至11%以上),即PLCs的DNA合成增加,細胞的增殖或分化可能增多。但是相對高劑量的TRH(1 ng/ml)卻不能促進PLCs的DNA合成,甚至BrdU摻入比例在10ng/ml TRH組略有下降(P=0.094)。將BrdU摻入時間延長至18和36hr,對照組和TRH處理組BrdU陽性細胞的數(shù)量和比例均增加(P0.01),即0.1ng/ml TRH可顯著促進PLCs的DNA合成。 結論 1.成功分離、純化了大鼠睪丸PLCs和ALCs,可用于原代培養(yǎng)下細胞學實驗。 2.成功合成EDS,并構建EDS誘導的成年大鼠Leydig細胞凋亡-再生模型。 3.TRH-R1和TRH-R2在大鼠睪丸出生后發(fā)育不同階段以及EDS誘導的Leydig細胞凋亡模型中僅表達于Leydig細胞,即處于成年型Leydig細胞譜系不同階段的Leydig細胞均表達TRH-R1和TRH-R2。另外,細胞培養(yǎng)顯示,TRH能夠影響成熟的ALCs睪酮合成分泌能力,以及Leydig祖細胞的DNA合成(增殖或分化)。故TRH及其受體參與了Leydig細胞譜系的發(fā)育和功能的調節(jié)。
[Abstract]:Background and purpose
Thyrotrophin-releasing hormone (TRH) is originally a 3 peptide extracted and purified from the hypothalamus of sheep and pigs. It combines with the thyrotrophin-releasing hormone receptors (TRHRs) receptor (thyrotrophin-releasing hormone receptors, TRHRs) in the anterior pituitary and stimulates the synthesis and secretion of thyroid stimulating hormone (TSH). Two receptors for TRH, TRH-R1 and TRH-R2, are cloned in the milk moving object, and both belong to the family members of the G protein coupling receptor family. The amino acid sequences of the same animals are consistent in the same animals. The immune active TRH and TRH receptors are distributed not only in the central nervous system of the hypothalamus and outside the hypothalamus, but also in the peripheral area. In the tissue, the testicles are the few organs in the peripheral tissue that can simultaneously express TRH and its two receptors, but the function of TRH and its receptors in the testis is not clear. The purpose of this experiment is to explore the significance of TRHRs expression in the testis of rats.
Research methods and contents
1. the expression and localization of TRH-R2 and TRH-R1 in the testis of the postnatal rats (8,14,21,35,60 and 90 days) were compared by the method of protein immunoblot hybridization and immunohistochemistry, and the expression was semi quantified by image analysis.
2. the Percoll continuous density gradient centrifugation was used to extract and purify the adult rat (90 days) rat testicular Leydig cells, and to explore the effect of different doses of TRH on the testosterone synthesis of Leydig cells.
3. EDS was synthesized and the EDS induced Leydig cell apoptosis model was constructed and verified. The expression of TRH-R1 and TRH-R2 during the regeneration of adult Leydig cells after EDS treatment was observed by Western blotting, immunohistochemistry and double immunofluorescence.
4. the Leydig progenitor cells were purified from the testis of 21d rats after birth, and the effects of different doses of TRH on the DNA synthesis of Leydig progenitor cells were observed by BrdU incorporation.
Result
1.Western blotting and immunohistochemistry detected the expression of TRH-R1 and TRH-R2 at different stages after the birth of the rat testis, located in the Leydig cells, the positive substance was located in the cytoplasm and the cytoplasm, and the same Leydig cell could simultaneously express the TRH-R1 and TRH-R2. image analysis to show that the expression intensity of the two in the different stages of Leydig cells in different stages. The largest expression of TRH-R2 is the postnatal 35d testis, mainly new and immature Leydig cells, while TRH-R1 is highly expressed in the testis of adult rats, mainly the mature Leydig cells.
2.Percoll continuous density gradient centrifugation was used to extract Leydig cells from adult rat testicles. After 3 beta -HSD enzyme cytochemical staining, the purity accords with the requirement of cytological experiment. After the treatment of different doses of TRH, the secretion of testosterone in the primary cultured Leydig cells is affected and is dose-dependent. The relative low dose of TRH (0.01 and 0.1 ng/ml) can be significantly inhibited. The testosterone secretion of ALCs based testosterone and hCG was less than 0.01, while the relative high dose of TRH (1 and 10 ng/ml) promoted the testosterone secretion under hCG stimulation (P0.05). Although the 1 ng/ml TRH group and 0.1 ng/ml TRH were not statistically different from the basal testosterone secretion, the level of testosterone was also elevated under 1 ng/ml.
3. after an intraperitoneal injection of EDS in rats at a dose of 75mg/kg, the apoptosis of Leydig cells in the testis disappeared after 2 D. By serum testosterone, 3 beta -HSD enzyme cytochemical staining, HE staining in paraffin section and immunohistochemical staining of 3 beta -HSD were confirmed by serum testosterone, and the animal model was replicated successfully. After EDS, Leydig cells degenerated within 24hr. After 2-3 days, all Leydig cells disappeared after.EDS treatment and 14d. The regeneration of long shuttle shaped Leydig cells appeared in the periinterstitial region. The number of Leydig cells in the newborn 28d increased and migrated from the peritubule to the mesenchyme, and turned into polygons.
The expression of TRH-R1 and TRH-R2 in the testis was detected by 14d, Western blotting and immunohistochemical staining after EDS treatment. At this time, the regeneration of Leydig progenitor cells in the rat testis was regenerated. It was further confirmed by double labeling fluorescence, that TRH-R1 and TRH-R2 positive cells were regenerated Leydig cells.
4. the Percoll continuous density gradient centrifugation was used to separate the Leydig progenitor cells from the postnatal 14d rats. After giving different doses of TRH (0.001-10 ng/ml) and adding 10 mu M BrdU to the culture medium, the PLCs DNA synthesis could be influenced by TRH. After 12 hours of incubation, the relatively low dose TRH could increase the positive rate. The number and proportion of the sex labeled cells (from 8.2% to more than 11%), that is, the DNA synthesis of PLCs increases, cell proliferation or differentiation may increase. But the relative high dose of TRH (1 ng/ml) does not promote DNA synthesis of PLCs, even the proportion of BrdU admixture decreases slightly in the 10ng/ml TRH group (P=0.094). The BrdU incorporation time is extended to 18 and 36hr, control, and 36hr, control The number and proportion of BrdU positive cells in both group and TRH treated group increased (P0.01), that is, 0.1ng/ml TRH significantly promoted DNA synthesis of PLCs.
conclusion
1. successfully isolated and purified PLCs and ALCs from rat testis, which can be used in primary culture cytology experiments.
2. EDS was successfully synthesized, and EDS induced apoptosis and regeneration model of adult rat Leydig cells was constructed.
3.TRH-R1 and TRH-R2 were expressed only in Leydig cells in the different stages of the development of rat testis and in the Leydig cell apoptosis induced by EDS, that is, the Leydig cells in the different stages of the adult Leydig cell lineage all express TRH-R1 and TRH-R2., and the cell culture shows that TRH can affect the capacity of the mature ALCs testosterone synthesis and secretion. And DNA synthesis (proliferation or differentiation) of Leydig progenitor cells. Therefore, TRH and its receptors are involved in the regulation of Leydig cell lineage development and function.
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R329

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本文編號：2071219