本文選題：鼠疫菌 + T3SS��； 參考：《南華大學(xué)》2013年碩士論文

【摘要】：目的： 1.病原菌的入侵通常引起宿主NF-κB信號通路的活化，，鼠疫菌蛋白SycE、YscL、YscS是T3SS的組成成分，YscL是為T3SS轉(zhuǎn)運效應(yīng)蛋白提供能量的YscNATTPase的調(diào)控蛋白；YscS是分泌裝置的成分蛋白。通過檢測鼠疫菌蛋白SycE、YPO2940、YPO3877、YscS和YscL對宿主NF-κB信號通路的影響，對初步研究鼠疫菌可能的致病機制提供依據(jù)。 2、YpkA是鼠疫菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白，VASP是人的一種細胞骨架調(diào)節(jié)蛋白，通過體外驗證YpkA對VASP的磷酸化作用，對鼠疫菌的致病可能的機制進行初步的探討。 方法： 1. LB液體培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)鼠疫耶爾森氏菌，試劑盒提取其基因組DNA。設(shè)計引物，PCR擴增yscL基因，插入pCMV-Myc質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCMV-Myc-yscL，經(jīng)測序分析正確后大量提取質(zhì)粒，去內(nèi)毒素后用于轉(zhuǎn)染293T細胞。 2.大量提取本實驗室已構(gòu)建好的表達SycE、YPO2940、YPO3877、YscS和YscL的pCMV-Myc去內(nèi)毒素提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細胞。 3.利用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)，將以上提取的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入293T細胞，以anti-Myc抗體為一抗，WB方法檢測以上5種蛋白在293T細胞中的表達。表達正確后，再分別與表達螢火蟲熒光素酶的pBII-LUC質(zhì)粒和表達海腎熒光素酶的pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞。然后用TNF-α刺激293T細胞，在化學(xué)發(fā)光板上檢測熒光素酶的活性。 4.在大腸桿菌BL21中表達YpkA蛋白，用Glutathione Sepharose4B珠子純化YpkA；在293T細胞中表達VASP，F(xiàn)lag珠子純化VASP。將純化的YpkA、VASP、ATP及磷酸激酶緩沖液混合，30℃反應(yīng)30min，設(shè)立陽性和陰性對照組，分別用WB和同位素標記法檢測VASP的磷酸化。 5.統(tǒng)計軟件SPSS13.0分析實驗結(jié)果，統(tǒng)計方法為方差分析。 結(jié)果： 1.序列分析結(jié)果顯示pCMV-Myc-yscL構(gòu)建正確。 2. WB結(jié)果顯示SycE、YPO2940、YPO3877、YscS和YscL在293T細胞中得到正確表達。 3.雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示：SycE、YPO3877、YscS和YscL實驗組的熒光素酶活性比陰性對照組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P 0.05）；YPO2940組熒光素酶活性比陰性對照組沒有降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。 4. WB結(jié)果沒有檢測到Y(jié)pkA對VASP的磷酸化作用，而同位素標記法檢測到了YpkA對VASP的磷酸化。 結(jié)論： 1.鼠疫菌蛋白SycE、YPO3877、YscS和YscL具有抑制NF-κB信號通路活化的作用，而鼠疫菌蛋白YPO2940沒有抑制293T細胞NF-κB信號通路活化的作用。 2.體外YpkA能夠?qū)ASP磷酸化。
[Abstract]:Objective: 1. The invasion of pathogenic bacteria usually causes the activation of NF- 魏 B signaling pathway. YSCL is the constituent of T3SS, YscL is the regulating protein of YscNATase which provides energy for T3SS transport effector protein, YscS is the component protein of secretory device. The effects of YPO3877 (YSCS) and YscL (YSCL) on the NF- 魏 B signaling pathway of the host were detected by the YP2940 protein of Yersinia pestis. 2. YpkA is a kind of cytoskeleton regulatory protein of Yersinia pestis type 鈪

本文編號：2064339