本文選題：腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)化酶 + 酶活性　； 參考：《華中科技大學(xué)》2009年博士論文

【摘要】： 第一部分底物肽-HPLC原位測定跨膜TACE活性方法的建立 【背景】 腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)換酶(Tumor necrosis factor-alpha converting enzyme,TACE,也即ADAM17)是將膜型腫瘤壞死因子α(mTNF-α)轉(zhuǎn)換為可溶性腫瘤壞死因子α(sTNF-α)的主要分泌酶,同時也介導(dǎo)許多其它細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體的加工脫落,在炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、增殖分化調(diào)節(jié)以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等眾多生理病理過程中發(fā)揮著重要的作用。但TACE如何特異性識別底物分子,如何進行活性調(diào)節(jié)和控制等,都是研究者們一直感興趣卻又沒能徹底解決的問題�；卮疬@些問題首先需要一種快速、準(zhǔn)確且重復(fù)性好的酶活性檢測方法,來實時觀測研究過程中的酶活性改變。常用的測定酶活性的方法主要有兩類:一是以檢測酶-底物反應(yīng)產(chǎn)物為基礎(chǔ)的方法,如底物肽-HPLC法、底物膠電泳法、MTT細(xì)胞毒實驗等,另一類是以檢測酶表達量為基礎(chǔ)的輔助方法,如酶聯(lián)免疫吸附(ELISAs)、Western Blot、流式細(xì)胞術(shù)(FACS)、間接免疫熒光等。前者主要應(yīng)用在酶活性調(diào)節(jié)研究上,如酶活性調(diào)節(jié)機制、酶抑制劑藥物等,后者則主要輔助探索酶活性改變的影響機制。 底物肽-HPLC法是將人工模擬底物肽與高效液相色譜技術(shù)(HPLC)結(jié)合起來的一種快速準(zhǔn)確且適合高通量篩選的酶活性檢測方法。即根據(jù)底物分子中被酶特異性識別和水解的特定序列,人工合成具有底物功能的寡肽,能夠被酶的活性中心識別、結(jié)合和特異性水解,且不易被其它蛋白酶降解。建立酶與底物模擬肽的催化水解反應(yīng)體系,并利用HPLC定量分析反應(yīng)產(chǎn)物的變化,從而評價酶對特定底物的專一性和催化活性。如果用紫外或熒光基團標(biāo)記底物肽分子,可以將檢測限降至納克級,提高檢測靈敏度。此方法直接監(jiān)測酶催化水解底物的產(chǎn)率變化,是最直觀最有力地評價酶活性的指標(biāo)。目前底物肽-HPLC法以其快速準(zhǔn)確,重復(fù)性好,靈敏度高,適合高通量藥物篩選研究等優(yōu)勢,在酶活性研究中得到廣泛的應(yīng)用。 【目的】 1.建立檢測TACE活性的TNFα模擬底物肽-HPLC方法,并通過與底物膠電泳、MTT細(xì)胞毒法、FACS等方法的比較,對該技術(shù)進行評估; 2.應(yīng)用所建立的底物肽-HPLC方法研究人重組TACE(rhTACE)對底物肽的酶促反應(yīng)動力學(xué),通過K_m,V_(max),k_(cat)/K_m等動力學(xué)常數(shù)的測定,評價rhTACE的底物專一性和催化活性,并通過與文獻數(shù)據(jù)對比驗證方法的可行性。 3.應(yīng)用所建立方法進行活細(xì)胞膜TACE活性研究。 【方法】 1.模擬TACE底物TNFα水解位點附近的氨基酸序列,合成高純度(95%)帶紫外標(biāo)記的底物肽段Dnp-SPLAQAVRSSSR-NH_2; 2.優(yōu)化適合分離底物肽及TACE水解后的裂解小肽的色譜操作條件,包括紫外吸收波長、梯度洗脫條件、流動相流速、進樣量等色譜參數(shù)的優(yōu)化和選擇。 3.優(yōu)化TACE-底物肽反應(yīng)體系,包括反應(yīng)緩沖體系的選擇,最適pH值,溫度的影響,反應(yīng)終止條件等。 4.TACE-底物肽酶促動力學(xué)研究。包括確定反應(yīng)初始速度階段所需的酶量,在一定酶量下不同底物肽濃度與反應(yīng)初速度之間的關(guān)系,并根據(jù)米氏方程利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法求出動力學(xué)常數(shù)K_m,V_(max),k_(cat)/K_m。 5.建立U937,HEK293細(xì)胞與底物肽的微升級反應(yīng)體系,HPLC法觀測細(xì)胞數(shù)量改變(即酶濃度的改變)對一定濃度底物肽水解反應(yīng)的影響,以及細(xì)胞酶激活劑與抑制劑對酶活性的影響。 6.多方法對比評估:底物明膠電泳法測定金屬蛋白酶(MMP),rhTACE對底物明膠的水解活性;MMT法觀察受PMA和LPS刺激的細(xì)胞上清中的可溶性TNFα(sTNFα)對L929的細(xì)胞毒性:FACS法檢測LPS刺激后細(xì)胞膜上TACE分子的表達量的改變。對以上各方法的靈敏度,適用范圍作出評價。 【結(jié)果】 1.確定了TACE-peptide體系的反相色譜分析條件(M5): [1]C8反相色譜柱(4.6mm×50mm); [2]檢測波長為350nm; [3]流動相為A:20%乙腈+80%水,B:60%乙腈+40%水,含1%TFA; [4]梯度洗脫條件為100%A平衡5min,隨后在20min內(nèi)將100%A線性遞變?yōu)?00%B; [5]流動相流速為0.8mL/min;進樣量為10～15μl。 2.確定了TACE-底物肽反應(yīng)緩沖體系的組成:25 mM Tris-HCl(pH 8.5),2.5μM ZnCl_2,5%Glycerol;加入1%TFA終止酶解反應(yīng)。 3.確定了在反相色譜分析條件(M5)下純肽的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,用來校正HPLC實測的峰面積與真實濃度的關(guān)系。 4.確定了酶促反應(yīng)初速度階段所需的酶量:當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0μM時,反應(yīng)初速度階段所需TACE的量應(yīng)≤1.5 ng/μl,所以在10～80μM底物肽反應(yīng)體系中,我們所加的TACE始終選擇為1 ng/μl。 5.測定了pH 8.5,溫度分別為25℃和37℃時TACE對底物肽的酶促反應(yīng)米氏常數(shù)K_m為62.84μM(37℃)和37.02μM(25℃),催化常數(shù)k_(cat)值為1.5407 s~(-1)(37℃)和0.5161 s~(-1)(25℃),專一性常數(shù)k_(cat)/K_m值為2.4×10~4 M~(-1)·s~(-1)(37℃)和1.4×10~4 M~(-1)·s~(-1)(25℃)。 6.HEK293細(xì)胞株穩(wěn)定表達TACE(ADAM17)及TNFα,但不表達其它基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP),可以減少反應(yīng)體系中的非特異性水解,是作為底物肽-HPLC法在細(xì)胞體系應(yīng)用的理想的細(xì)胞模型。在100μl的自然細(xì)胞反應(yīng)體系中,20min以內(nèi)幾乎檢測不到TACE產(chǎn)物峰;但使用金屬蛋白酶激活劑PMA和藥物(小檗堿)處理細(xì)胞后再與底物肽發(fā)生酶促反應(yīng),則可以在較短的反應(yīng)時間(≤20min)內(nèi)準(zhǔn)確檢測到TACE產(chǎn)物峰,并觀察到使用金屬蛋白酶抑制劑時產(chǎn)物峰面積減小,且都與處理時間和濃度呈線性變化關(guān)系。純酶體系和細(xì)胞體系的產(chǎn)物峰,均通過HPLC-MASS聯(lián)用分析得以證實。 7.底物明膠電泳實驗結(jié)果表明,經(jīng)過LPS刺激后的U937細(xì)胞的MMP酶譜表達有明顯增加,但rhTACE的用量達50ng仍未能得到陽性結(jié)果:MMT細(xì)胞毒實驗結(jié)果表明,在LPS和PMA刺激下的HL-60和U937細(xì)胞產(chǎn)生sTNF-α的變化,發(fā)現(xiàn)刺激組的細(xì)胞上清對L929的殺傷率比對照組有明顯提高;FACS實驗結(jié)果表明,LPS刺激對膜蛋白TACE的表達量沒有相應(yīng)顯著的變化。結(jié)果表明:底物膠電泳法不適合進行TACE活性檢測:MTT法步驟繁瑣,重復(fù)性差,不能嚴(yán)格定量分析:FACS法只能提供活性相關(guān)的輔助信息;而相比之下,底物肽-HPLC法能嚴(yán)格定量研究酶促反應(yīng)動力學(xué),更能對跨膜TACE實現(xiàn)原位活性測定。 【結(jié)論】 本文成功建立了底物肽-HPLC方法用來測定TACE活性,確定了TACE-底物肽體系的最佳反應(yīng)條件及底物肽與TACE裂解產(chǎn)物肽的最佳HPLC分離條件,并測定了TACE與底物肽的反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)K_m、V_(max)和k_(cat)/K_m,均符合酶促反應(yīng)動力學(xué)行為。在使用同類方法測定金屬蛋白酶活性的文獻數(shù)據(jù)中,k_(cat)/K_m值大多在10~4～10~5M~(-1)·s~(-1),與我們所測定的2.4×10~4 M~(-1)·s~(-1)(37℃)和1.4×10~4M~(-1)·s~(-1)(25℃)相符,這些數(shù)據(jù)充分證實了我們所建立的底物肽-HPLC方法測定TACE活性的可行性。首次嘗試將底物肽-HPLC測定TACE活性的方法應(yīng)用在活細(xì)胞體系,對細(xì)胞反應(yīng)體系作了優(yōu)化和改良,使微升體系的活細(xì)胞膜酶TACE活性的原位檢測成為可能,并得到了較理想的結(jié)果,這也是本文的重要創(chuàng)新點之一。首次選用HEK293細(xì)胞作為反應(yīng)體系的細(xì)胞模型,并發(fā)現(xiàn)該模型可以有效簡化裂解產(chǎn)物肽HPLC峰譜。酶激活劑和抑制劑對HEK293細(xì)胞膜酶TACE活性的調(diào)節(jié)可以通過HPLC圖譜上底物肽產(chǎn)物峰的面積變化得到直觀而有效的評價。 本方法在細(xì)胞體系上的應(yīng)用,彌補了底物明膠電泳的對底物需求量大,不能用于活細(xì)胞檢測;MMT法的間接、步驟繁瑣、重復(fù)性差;FACS方法只能輔助提供酶活性信息等各方法諸多無法克服的缺點,不僅能直觀準(zhǔn)確地反應(yīng)酶活性,還能進行較大樣本對比分析,這將對進一步探索細(xì)胞跨膜TACE活性調(diào)節(jié)機制及抑制劑的初步篩選提供重要的技術(shù)支持。 第二部分細(xì)胞膜的脂質(zhì)微環(huán)境對膜酶—TACE活性的調(diào)節(jié) 【背景】 脂筏是細(xì)胞膜脂雙層結(jié)構(gòu)的亞結(jié)構(gòu)域。脂筏內(nèi)膽固醇含量較高,比周圍質(zhì)膜的流動性低,其主要功能是為膜蛋白分子的組裝提供了一個平臺,便于它們的聚集和相互作用,并有利于蛋白質(zhì)形成有效的構(gòu)象。適當(dāng)?shù)哪懝檀己渴蔷S持脂筏穩(wěn)定的必要因素,膽固醇含量的降低將導(dǎo)致細(xì)胞膜的流動性增加繼而導(dǎo)致脂筏解體,使處在脂筏上的某些脫落酶或其底物分子的構(gòu)象發(fā)生改變,相互接觸并發(fā)生水解,從而觸發(fā)細(xì)胞的各種生理、病理反應(yīng)。 為了探索在機體自然衰老過程中或在某些老年性疾病的病理過程中細(xì)胞膜微環(huán)境所發(fā)生的對應(yīng)改變以及這些改變對細(xì)胞功能的影響,從而為尋找相應(yīng)的對策及調(diào)節(jié)點,以延緩衰老過程這也是本課題研究的目標(biāo)所在。其中,ADAM家族中的ADAM17、ADAM10、ADAM9等成員,由于對腦組織中的淀粉樣前體APP具有特異的水解加工作用,因此這類與APP加工有關(guān)的α-分泌酶的活性及變化,表達及調(diào)控都是研究的熱點之一。 已有眾多報道圍繞著脂類物質(zhì)含量對脂筏及細(xì)胞膜功能的影響,現(xiàn)已證實膽固醇含量改變對TACE的眾多跨膜底物如APP(amyloid precursor protein)、CD30、L-選擇素、L1黏附分子等的胞外結(jié)構(gòu)域脫落有影響,提示膜膽固醇含量的變化與TACE的活性之間可能存在某種聯(lián)系。使用物理性膽固醇剝奪劑甲基-β-環(huán)糊精(methyl-β-cyclodextrin,M~βCD)去除細(xì)胞膽固醇不影響細(xì)胞的其它生理生化過程,是目前常用的降低質(zhì)膜膽固醇含量的方法,質(zhì)膜中膽固醇含量的變化可以直接導(dǎo)致脂筏狀態(tài)的改變。利用與膜脂分子結(jié)合的熒光探劑測定細(xì)胞膜流動性改變可以評價質(zhì)膜中脂筏的狀態(tài)。 小檗堿(berberine,BBR)是我國傳統(tǒng)中藥黃連素的主要活性成分,具有明顯的降膽固醇作用。BBR最初是作為清熱解毒藥和抗菌藥應(yīng)用于臨床,后來逐漸發(fā)現(xiàn)它具有降血糖、降血脂、抗血小板、抗老年斑、抗腫瘤等多種藥理作用,而上述疾病的發(fā)生發(fā)展都與TACE對膜底物分子的脫落加工有著緊密的聯(lián)系。BBR的這些藥理作用對細(xì)胞膜流動性的影響,及其對細(xì)胞膜脂筏中TACE與底物分子的相互作用的調(diào)節(jié)等問題都是研究的新課題,為此,本部分將作方法學(xué)和細(xì)胞模型體系的探討,并以TACE(ADAM17)為代表進行膜結(jié)構(gòu)與功能的初步研究。 【目的】 1.建立基于FACS技術(shù)的細(xì)胞膜流動性檢測方法。 2.研究M~βCD降低細(xì)胞膜膽固醇含量所帶來的細(xì)胞膜流動性的改變以及TACE活性的變化,為膜流動性與TACE活性之間的因果關(guān)系提供證據(jù)。 3.調(diào)查BBR對細(xì)胞膜流動性及TACE活性的影響。 4.從細(xì)胞膜流動性的角度探討B(tài)BR對細(xì)胞膜TACE活性的影響機制。 【方法】 1.細(xì)胞膜流動性檢測方法的建立: 用流式細(xì)胞儀(FACS)測定膜脂與熒光探劑MC540結(jié)合后的二維散點圖和頻數(shù)分布,檢測脂質(zhì)分子的堆積程度,進而反映膜脂流動性。 2.從兩方面弄清物理性剝奪細(xì)胞膜膽固醇后導(dǎo)致的膜流動性變化: (1)鏡下觀察M~βCD處理HEK293和U937細(xì)胞后形態(tài)的變化; (2)用FACS法檢測M~βCD處理HEK293和U937細(xì)胞后膜脂質(zhì)分子的堆積程度的變化。 3.從兩方面評價M~βCD對TACE活性的影響: (1)用MTT細(xì)胞毒法研究M~βCD處理HEK293和U937細(xì)胞后上清中sTNFα的變化; (2)用所建立的底物肽-HPLC方法研究M~βCD處理后細(xì)胞-peptide反應(yīng)體系的反應(yīng)進程產(chǎn)率變化。 4.調(diào)查不同濃度BBR處理HEK293和U937細(xì)胞不同時間后細(xì)胞膜流動性的改變,證明BBR處理與細(xì)胞膜流動性之間的聯(lián)系。 5.用上述方法調(diào)查TACE活性變化與BBR濃度與處理時間的關(guān)系,即用底物肽-HPLC方法研究BBR處理后細(xì)胞-peptide反應(yīng)體系的反應(yīng)進程產(chǎn)率變化;用MTT細(xì)胞毒法研究細(xì)胞上清中sTNFα的變化,并與M~βCD及PMA處理組做對比,證明BBR處理與TACE活性之間的聯(lián)系。 6.用RT-PCR法研究BBR對HEK293和U937細(xì)胞的TACE mRNA的影響,排除調(diào)查BBR影響TACE活性的其它可能途徑。 【結(jié)果】 1.測膜流動性方法建立:FACS檢測的二維散點分布圖和頻數(shù)分布圖均表明,當(dāng)細(xì)胞膜膽固醇被M~βCD物理性剝奪后,無論是懸浮U937還是貼壁HEK293細(xì)胞,均明顯向高熒光強度區(qū)域擴散,且分布相對松散,這表明膜脂分子的體積增大,堆積程度更為疏松,提示細(xì)胞膜流動性的增加,結(jié)果與文獻報道一致,可以確定基于FACS的細(xì)胞膜流動性檢測方法的可行性。 2.膜流動性實驗結(jié)果: (1)經(jīng)M~βCD處理過的HEK293細(xì)胞,其細(xì)胞形態(tài)明顯地由貼壁的梭形變?yōu)椴灰?guī)則的橢圓形,且形態(tài)變化趨向橢圓形與M~βCD的處理量和處理時間成正比。當(dāng)8mM的M~βCD處理細(xì)胞1h或者16mM的M~βCD處理細(xì)胞2h后,細(xì)胞膜邊緣模糊,細(xì)胞貼壁不牢,有凋亡傾向。 (2)用M~βCD處理1h后的U937和HEK293細(xì)胞膜表面熒光強度明顯增強,細(xì)胞群向高熒光區(qū)域分布更加彌散,且隨著M~βCD濃度的增加(0,8,16mM),其膜表面熒光強度值也相應(yīng)增加(HEK293:149,470,904;U937:177,892,2242)。U937細(xì)胞經(jīng)M~βCD處理后在此方面較HEK293細(xì)胞更為突出。表明M~βCD處理可以增加細(xì)胞膜流動性。 (3)經(jīng)BBR(10～40μg/mL)處理過的U937和HEK293細(xì)胞群明顯向高熒光區(qū)域分布,且彌散程度增大(HEK293:BBR 0、5、10、20、40、60、80μg/mL,熒光強度值606、687、718、1045、1165、832、730;U937:BBR 0、5、10、20、30、40gg/mL,熒光強度值175、180、218、264、262、208)。隨著BBR濃度的增加,散點的分布區(qū)域逐漸擴大,提示膜流動性的增加。與M~βCD處理組對比,BBR處理組增加U937和HEK293胞膜流動性不如直接降低膜膽固醇含量效果顯著。 結(jié)果表明:BBR處理細(xì)胞與M~βCD處理結(jié)果一致,二者均對細(xì)胞產(chǎn)生膜流動性增加的影響。 3.細(xì)胞毒實驗結(jié)果: (1)4mM和8mM M~βCD分別處理U937 2h后對A549細(xì)胞的殺傷率相應(yīng)為11.2%和16.8%,可見隨著M~βCD濃度加大sTNF-α的分泌相應(yīng)增加。 (2)15μg/mL和30μg/mL BBR分別處理U937細(xì)胞后上清對A549的殺傷率為相應(yīng)為0.5%和0.7%:100ng/mL PMA處理組的殺傷率達到19.1%;100ng/mLPMA和30μg/mL BBR同時處理U937后,殺傷率下降為7.5%;高于40μg/mL時,BBR促使A549凋亡。結(jié)果提示BBR不誘發(fā)sTNFα的分泌,同時可以抑制PMA對U937的刺激作用。 sTNF-α的細(xì)胞毒實驗可以間接評價其主要分泌酶TACE的活性。結(jié)果表明,BBR處理細(xì)胞并未表現(xiàn)出與M~βCD和PMA處理的一致性,原因可能與它抑制內(nèi)毒素的作用有關(guān)。同時發(fā)現(xiàn)當(dāng)BBR的濃度大于40μg/mL,或者共孵育時間超過24h,則會促進A549細(xì)胞凋亡。 4.底物肽-HPLC實驗測TACE活性結(jié)果: (1)8mM和16mM的M~βCD處理HEK293細(xì)胞30min后,觀察活細(xì)胞膜上水解酶對TNF-α模擬肽Dnp-SPLAQAVRSSSR-NH_2的水解活性。發(fā)現(xiàn)經(jīng)M~βCD處理后TACE的特異性裂解肽峰峰面積比例明顯增加,且隨著M~βCD處理濃度(8～16mM)和酶解反應(yīng)時間(5～15min)的增加,裂解肽峰面積比例也相應(yīng)增加。 (2)10μg/mL和20μg/ mL BBR分別處理HEK293細(xì)胞6h和24h后,將細(xì)胞與底物肽共孵育,在反應(yīng)初期(5-15min)觀察到TACE特異性裂解肽峰峰面積比例較未處理前增加,且有濃度時間依賴關(guān)系。裂解峰峰面積的增加說明酶促反應(yīng)產(chǎn)率的增加,提示TACE水解活性的增強。BBR處理細(xì)胞與M~βCD處理結(jié)果一致,表明二者都能增強膜酶TACE水解活性。 5.RT-PCR實驗中,以看家基因β-actin為參照,處理組和對照組的TACE mRNA水平在12h和24h均沒有顯著性差異(p＜0.05)。結(jié)果表明,不支持BBR通過增強TACE基因轉(zhuǎn)錄或mRNA穩(wěn)定性來影響TACE活性的分子機制。 【結(jié)論】 本部分成功建立了基于FACS技術(shù)的細(xì)胞膜流動性檢測方法。該方法對懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞均可適用。該方法與傳統(tǒng)的DPH標(biāo)記熒光偏振檢測技術(shù)相比較,具有準(zhǔn)確性更高,操作更簡單,可重復(fù)定量分析等突出的優(yōu)點,同時也是對FACS技術(shù)應(yīng)用的一個新的嘗試。本文利用該方法定性分析了細(xì)胞膜膽固醇降低所導(dǎo)致的質(zhì)膜流動性的增加,與文獻報道一致。 安全無毒的傳統(tǒng)中藥黃連素小檗堿(BBR),已有研究證明具有降膽固醇含量的藥理作用,并因而可用于輔助治療高血脂癥;同時黃連素還具有顯著的抑制血管平滑肌增殖、抗血小板、抗炎、抗老年斑和抗腫瘤等作用,因而在心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面有廣泛應(yīng)用前景。本文試圖將黃連素的這些藥理活性與膜流動性增加建立聯(lián)系,并通過觀察黃連素對TACE水解活性和mRNA表達水平的影響,初步探索黃連素對TACE活性影響的機制。 首先證實了物理性降低膜膽固醇可以帶來膜流動性的增加,也可以增加細(xì)胞膜酶的水解活性;然后證實了BBR同樣有上述行為,同時并不增加TACEmRNA的表達水平。結(jié)果提示BBR增加TACE活性可能循于細(xì)胞膜流動性增加而導(dǎo)致的脂筏上酶分子構(gòu)象變化而被激活的機制,而不支持BBR導(dǎo)致TACE在膜上的表達增加的分子機制。這為BBR的調(diào)脂和抗老年斑抗腫瘤活性提供了一種新的解釋和研究思路,從理論上支持了抗衰老的“加強α-分泌酶活性”的指導(dǎo)策略,也指出了一條用中藥進行調(diào)節(jié)的新途徑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R341

【參考文獻】

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本文編號：2003302