本文選題：miRNAs + 3T3-L1脂肪細胞��； 參考：《中南大學(xué)》2009年博士論文

【摘要】： 第一部分miRNAs在3T3-L1脂肪細胞和胰島素抵抗脂肪細胞中的差異表達 目的: 1.探討正常3T3-L1脂肪細胞和胰島素抵抗(insulin resistance,IR)脂肪細胞中微小RNA(miRNAs)的表達是否存在差異。 2.篩選幾個可能與IR相關(guān)的miRNAs,尋找其靶基因,以進一步研究miRNAs在IR中的作用。 方法: 1.IR脂肪細胞模型的建立 采用高糖/高胰島素處理3T3-L1脂肪細胞24小時,通過葡萄糖消耗實驗和[~3H]葡萄糖攝取實驗判斷模型是否建立。 2.miRNAs的差異表達 運用miRNAs芯片技術(shù)檢測3T3-L1脂肪細胞和IR脂肪細胞中差異表達的miRNAs。 3.IR相關(guān)的幾個miRNAs及其靶基因的篩選 根據(jù)基因芯片結(jié)果,借助生物信息學(xué)方法,對顯著變化的某些miRNAs進行分析,篩選幾個可能與IR相關(guān)的miRNAs及其調(diào)控的靶基因。 結(jié)果: 1.IR脂肪細胞模型的建立 高糖/高胰島素分別使3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗量和[~3H]葡萄糖攝取率下降75%和161%,與脂肪細胞組相比差異有顯著性,結(jié)果表明IR脂肪細胞模型成立。 2.miRNAs芯片分析 miRNAs芯片結(jié)果顯示:miRNAs在IR脂肪細胞中比在脂肪細胞中表達水平升高2倍以上者有50個,表達水平降低至1/2以下者有29個;且miR-320上調(diào)最明顯,miR-21下調(diào)最明顯。 3.IR相關(guān)的幾個miRNAs及其靶基因 應(yīng)用生物信息學(xué)方法,我們選取了3個可能與IR相關(guān)的miRNAs(miR-320,298和miR-21)進行下一步的功能實驗,Pik3r1可能是他們的靶基因。 結(jié)論: 1.高糖和高胰島素可誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細胞產(chǎn)生IR。 2.脂肪細胞和IR脂肪細胞中存在miRNAs的差異表達。 第二部分miRNAs對3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗的調(diào)節(jié)作用及其分子機制 目的: 1.針對miR-320和miR-298設(shè)計相應(yīng)的反義寡核苷酸(AMO-miR-320,AMO-miR-298),同時構(gòu)建含miR-21前體的重組質(zhì)粒(pSilencer 3.1-miR-21)。以脂質(zhì)體為載體介導(dǎo),觀察AMO-miR-320,AMO-miR-298及pSilencer 3.1-miR-21對3T3-L1脂肪細胞和IR脂肪細胞糖代謝的影響。了解這3個miRNAs在正常和病理狀況下有無促進葡萄糖攝取和改善IR的作用。 2.對能改善脂肪細胞IR的miRNAs,進一步探討其作用機制。 方法: 1.miRNAs對正常及IR脂肪細胞葡萄糖消耗的影響 實驗分7組:脂肪細胞組、脂質(zhì)體組、AMO-miR-298組、AMO-miR-320組、miRNA無關(guān)對照組(control oligo組)、pSilencer3.1-miR-21組和空質(zhì)粒組。脂肪細胞轉(zhuǎn)染4-6h小時后,用含0.2%BSA的正常糖/正常胰島素或高糖/高胰島素培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時,以葡萄糖氧化酶法檢測每孔培養(yǎng)液中葡萄糖的含量,與未接種細胞的空白孔的糖含量均值相減,計算葡萄糖的消耗量。 2.miRNAs對正常及IR脂肪細胞葡萄糖攝取的影響 實驗分組及細胞處理同上,24小時后,通過葡萄糖攝取實驗檢測各組脂肪細胞對葡萄糖攝取的影響。 3.miRNAs對IR脂肪細胞PI-3K、Akt、GLUT4的表達和GLUT4轉(zhuǎn)位的影響 實驗分7組:脂肪細胞組、IR脂肪細胞組(IR組)、AMO-miR-320+IR組、脂質(zhì)體+IR組、miRNA無關(guān)對照+IR組、pSilencer 3.1-miR-21+IR組和空質(zhì)粒+IR組。實驗結(jié)束時,通過western-blot檢測各組細胞(P1-3K,Akt和GLUT4)的蛋白表達及細胞外膜蛋白中GLUT4蛋白的含量;熒光定量PCR檢測P1-3K,Akt和GLUT4基因表達水平。 結(jié)果: 1.miRNAs對正常3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗和攝取的影響 基礎(chǔ)狀態(tài)下,3種miRNAs對3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗和攝取無顯著性影響;在100nmol/L胰島素存在的條件下,各組脂肪細胞對葡萄糖的消耗和攝取都顯著增加,分別是基礎(chǔ)狀態(tài)下的2.2-2.3倍和4.2-4.4倍,但組間無顯著性差異。 2.miRNAs對IR脂肪細胞葡萄糖消耗和攝取的影響 基礎(chǔ)狀態(tài)下,IR組和脂肪細胞組葡萄糖消耗量和攝取率無顯著性差異。在100nmol/L胰島素存在下,與脂肪細胞組相比,IR組葡萄糖消耗量和攝取率顯著下降;與IR組比較,AMO-miR-320+IR組和pSilencer 3.1-miR-21+IR組葡萄糖消耗量分別增加了18.5%和14.9%(P＜0.05),葡萄糖攝取率分別增加了57.3%和46.2%(P＜0.05);其他各組與IR組相比,葡萄糖消耗量和攝取率無顯著性差異。 3.miRNAs對IR脂肪細胞PI-3K、Akt、GLUT4的表達和GLUT4轉(zhuǎn)位的影響 Western-blot顯示:與脂肪細胞組相比,IR組PI3K p85蛋白表達和Akt絲氨酸磷酸化水平分別下降了42.7%和54.8%;AMO-miR-320和miR-21可完全恢復(fù)IR脂肪細胞PI3K p85表達;同時使IR脂肪細胞Akt絲氨酸磷酸化水平分別提高28.5%和33.9%。此外,IR組較脂肪細胞組GLUT4蛋白表達顯著下降51.1%,AMO-miR-320可使IR脂肪細胞GLUT4蛋白水平提高29.6%;pSilencer 3.1-miR-21+IR組GLUT4蛋白表達水平輕微提高,但與IR組相比無顯著性差異。葡萄糖轉(zhuǎn)位分析表明:IR脂肪細胞GLUT4蛋白轉(zhuǎn)位顯著降低,僅為正常脂肪細胞的33.7%。我們以IR組GLUT4蛋白轉(zhuǎn)位量作為基值,各組與之相比計算GLUT4蛋白轉(zhuǎn)位的相對定量。AMO-miR-320和miR-21分別使IR脂肪細胞GLUT4蛋白轉(zhuǎn)位增加168.7%和149.4%。熒光定量PCR結(jié)果表明:脂肪細胞組PI3K、Akt和GLUT4 mRNA的表達分別是IR組的8.57,16和18.4倍;AMO-miR-320可使IR組Akt和GLUT4 mRNA表達升高4.29和12.1倍,但不影響PI3K mRNA表達水平;miR-21可使IR組PI3K、Akt和GLUT4 mRNA的表達分別提高4.92,6.06和6.96倍。其余各組與IR組相比,上述指標(biāo)無顯著性差異。 結(jié)論: 1.AMO-miR-320和miR-21可促進IR脂肪細胞糖代謝、改善IR。 2.AMO-miR-320和miR-21可能是通過作用PI3K P85和PI3KP85上游基因,提高Akt絲氨酸磷酸化水平,促進GLUT4的轉(zhuǎn)位來發(fā)揮改善IR的作用。 第三部分脂肪細胞分化過程中miRNAs差異表達及功能研究 目的: 1.探討3T3-L1前脂肪細胞和間質(zhì)干細胞(MSC)分化成脂肪細胞過程中差異表達的miRNAs。 2.觀察miR-320、miR-21和miR-375對3T3-L1脂肪細胞分化的影響;對能影響脂肪細胞分化的miRNAs,進一步探討其作用機制。 方法: 1.脂肪細胞分化過程中miRNAs的差異表達 分別將3T3-L1前脂肪細胞和分離培養(yǎng)的MSC誘導(dǎo)分化,通過油紅O染色檢測細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積情況、RT-PCR方法檢測過氧化物酶體增殖物激活受體γ2(PPARγ2)和脂肪性脂肪酸結(jié)合蛋白(aP2)的表達,判斷3T3-L1前脂肪細胞和MSC分化情況。運用miRNAs芯片技術(shù)檢測3T3-L1前脂肪細胞和3T3-L1脂肪細胞;MSC和MSC-脂肪細胞中差異表達的miRNAs。 2.脂肪細胞分化相關(guān)的miRNAs的篩選及其靶基因的預(yù)測 根據(jù)基因芯片結(jié)果,借助生物信息學(xué)方法,對3T3-L1前脂肪細胞分化過程中顯著變化的1個miRNA及前面已經(jīng)證明對脂肪細胞IR有作用的2個miRNAs(miR-320和miR-21)進行靶基因預(yù)測。 3.miR-21和miR-375對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響 構(gòu)建含miR-21和miR-375前體的重組質(zhì)粒(pSilencer 3.1-miR-21和pSilencer 3.1-miR-375),通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染3T3-L1細胞。隨后將正常和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的3T3-L1前脂肪細胞誘導(dǎo)分化,實驗結(jié)束時進行油紅O染色,判斷脂肪細胞的分化情況。 4.AMO-miR-320對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響 實驗共分4組:分別為3T3-L1對照組、3T3-L1脂肪細胞組、AMO-miR-320組和miRNAs無關(guān)對照組。3T3-L1前脂肪細胞常規(guī)培養(yǎng),在誘導(dǎo)分化前分別將AMO-miR-320和無關(guān)對照序列轉(zhuǎn)入細胞。轉(zhuǎn)染3天后當(dāng)細胞生長融合時開始誘導(dǎo),實驗結(jié)束時進行油紅O染色,判斷脂肪細胞的分化情況。 5.miR-375促進3T3-L1前脂肪細胞的分化及可能機制 為進一步觀察miR-375是否促進3T3-L1前脂肪細胞的分化及其可能機制,我們將3T3-L1前脂肪細胞(對照組)和pSilencer3.1-miR-375穩(wěn)定轉(zhuǎn)染3T3-L1前脂肪細胞(miR-375組)誘導(dǎo)分化,通過RT-PCR實驗檢測在分化的不同時間(0,3,5,7,9天)aP2和PPARγ2基因表達;高效液相色譜檢測脂肪細胞內(nèi)甘油三酯含量;Western-blot檢測分析各實驗組ERK1/2、PPARγ2和aP2蛋白的表達。 結(jié)果: 1.miRNAs芯片分析 誘導(dǎo)分化結(jié)束時,兩種脂肪細胞內(nèi)均含許多脂滴,90%以上的細胞能被油紅O染色;且PPARγ2和aP2的基因表達顯著增加,這些結(jié)果表明3T3-L1前脂肪細胞和MSC分化成成熟的脂肪細胞。芯片結(jié)果顯示:3T3-L1前脂肪細胞分化成脂肪細胞上調(diào)的miRNAs有26個,下調(diào)的miRNAs有2個;小鼠MSC分化成脂肪細胞上調(diào)的miRNAs有20個,下調(diào)的miRNAs有55個。 2.脂肪細胞分化相關(guān)的miRNAs及其靶基因 應(yīng)用生物信息學(xué)方法,我們選擇了3個可能與脂肪細胞分化相關(guān)的miRNAs(miR-320,21和miR-375),且MAPK1(ERK2)可能是這3個miRNAs的靶基因。 3.miRNAs對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響 油紅O染色結(jié)果表明:miR-375顯著增加脂肪細胞的OD值,而miR-21和AMO-miR-320對脂肪細胞的OD值無顯著影響,提示miR-375能促進3T3-L1前脂肪細胞分化。 4.miR-375促進3T3-L1前脂肪細胞的分化及可能機制 RT-PCR結(jié)果表明:對照組和miR375組在分化過程中PPARγ2和aP2表達逐日增加;但miR375組從分化的第5天起PPARγ2和aP2表達顯著高于對照組。高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn):miR375使脂肪細胞內(nèi)甘油三酯含量顯著增加(12.1±0.46 vs 10.8±0.34 mg/mg prot,p＜0.01)。Western-blot結(jié)果顯示:miR-375使3T3-L1脂肪細胞ERK1和ERK2蛋白分別下降了27.4%和28.2%,PPARγ2和aP2蛋白表達分別提高了49.6%和52.8%(P＜0.01);空質(zhì)粒對上述指標(biāo)無顯著影響。 結(jié)論: 1.3T3-L1前脂肪細胞和MSC分化成脂肪細胞過程中存在差異表達的miRNAs。 2.miR-375可促進3T3-L1前脂肪細胞分化,其機制可能是通過抑制ERK1/2蛋白的表達、提高PPARγ2和aP2蛋白的表達。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R587;R346

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本文編號：1973852