本文選題：人乳頭瘤病毒16型(HPV16) + E2蛋白��； 參考：《南華大學》2013年碩士論文

【摘要】：目的：研究人乳頭瘤病毒16型（HPV16）E2蛋白與Daxx的相互作用，為進一步探討兩種蛋白質相互作用在HPV16致癌中的作用及其機制提供實驗參考依據(jù)。 方法： (1)用PRIMER5.0軟件分別設計HPV16E2及其結構域基因片段(氨基酸1-201、202-365和249-365)特異性引物，并引入EcoRI、BamHI酶切位點，PCR擴增目的基因。分別用EcoRI和BamHI雙酶切PCR產(chǎn)物和質粒pGADT7，純化回收酶切產(chǎn)物，T4連接酶連接后，轉化E.coli JM109，篩選陽性克隆。經(jīng)酶切鑒定及DNA序列分析，構建酵母菌表達載體pGADT7/HPV16E2、pGADT7/HPV16E2TAD、pGADT7/HPV16E2H-DBD和pGADT7/HPV16E2DBD。 (2)應用LiAc法，分別將誘餌質粒pGBKT7/Daxx與獵物質粒pGADT7和pGADT7/HPV16E2轉化酵母菌AH109，涂布于SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-His、SD/-Ade(單缺)固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2-4d，檢測誘餌質粒和獵物質粒對酵母菌AH109的自激活作用。 (3)將質粒分為7組，它們分別是A組(pGADT7+pGBKT7)、B組(pGADT7-T+pGBKT7-Lam)、C組(pGADT7-T+pGBKT7-p53)、 D組(pGBKT7/Daxx+pGADT7/HPV16E2)、E組(pGBKT7/Daxx+pGADT7/HPV16E2TAD)、F組(pGBKT7/Daxx+pGADT7/HPV16E2H-DBD)和G組(pGBKT7/Daxx+pGADT7/HPV16E2DBD)。將每組質粒共轉化酵母菌AH109，轉化菌分別接種于SD/-Trp-Leu固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2~4d，待平板上長出菌落后，接種單個菌落于SD/-Trp-Leu-His和SD/-Trp-Leu-His-Ade平板上，30℃培養(yǎng)2~4d，觀察酵母菌的生長情況，分析Daxx與HPV16E2相互作用及其氨基酸結構域。 (4)將pcDNA3.1/Daxx用BamHI酶切，收獲約2.2kb片段，連入載體pet28a相同位點，篩選陽性克隆，構建6His-Daxx融合蛋白原核細胞表達載體pet28a/Daxx。分別培養(yǎng)E.coli BL21（含pet28a/Daxx或pGEX6p-1/HPV16E2質粒），，IPTG誘導表達目的產(chǎn)物6His-Daxx或GST-HPV16E2，Ni-NTA或GST純化試驗盒分別純化目的蛋白，SDS-PAGE和Western blot分析和鑒定融合蛋白。 (5)取6His-Daxx和GST-HPV16E2融合蛋白純化產(chǎn)物各0.5μg混合，加入抗GST或抗His抗體及500μl裂解緩沖液，進行免疫共沉淀試驗（COIP）和Western blot；培養(yǎng)Caski細胞48h，收集細胞裂解液，經(jīng)蛋白質A/G瓊脂糖處理后，收集上清液，進行COIP和Western blot；IP抗體為抗Daxx或抗HPV16E2抗體，Western blot抗體為抗HPV16E2或抗Daxx抗體。 (6)培養(yǎng)Caski細胞，利用間接免疫熒光試驗和圖像軟件觀察并分析HPV16E2蛋白和Daxx在Caski細胞內分布與定位或共定位。 結果： (1) DNA序列分析結果顯示HPV16E2及其結構域基因片段均正確地連入pGADT7載體，即構建了酵母菌表達載體pGADT7/HPV16E2、pGADT7/HPV16E2TAD、pGADT7/HPV16E2H-DBD和pGADT7/HPV16E2DBD。 (2)轉化了誘餌質粒pGBKT7、pGBKT7/Daxx的酵母菌AH109，在SD/-Trp固體培養(yǎng)基上可見菌落生長，而在SD/-Leu、SD/-His、SD/-Ade未見菌落生長。轉化了獵物質粒pGADT7、pGADT7/HPV16E2的酵母菌AH109，在SD/-Leu固體培養(yǎng)基上可見菌落生長，在SD/-Trp、SD/-His、SD/-Ade培養(yǎng)板上未見菌落生長，即誘餌質粒和獵物質粒均無自激活作用。 (3)A～G組質粒轉化的酵母菌在SD/-Trp-Leu平板上均可見菌落生長。在SD/-Trp-Leu-His和SD/-Trp-Leu-His-Ade平板上，只有C、D、E組轉化菌生長，A、B、F、G組未見菌落生長。 (4)酶切鑒定結果顯示，Daxx正確地連入pet28a載體，即構建了Daxx原核表達載體pet28a/Daxx。在E.Coli BL21，IPTG誘導其表達了6His-Daxx融合蛋白。COIP和Westernblot結果顯示，在約90kDa與70kDa有條帶，即HPV16E2與Daxx在細胞外發(fā)生了結合反應。 (5)利用Caski細胞裂解上清液，COIP和Western blot結果顯示，在約80kDa與60kDa出現(xiàn)條帶，即HPV16E2與Daxx在細胞內發(fā)生了結合反應。 (6)在Caski細胞，表達紅色信號的HPV16E2和表達綠色信號的Daxx主要分布于Caski細胞胞漿，少數(shù)分布于細胞核；當紅色信號與綠色信號重疊時，出現(xiàn)黃色信號。 結論： (1)載體pGADT7/HPV16E2、pGADT7/HPV16E2TAD、pGADT7/HPV16E2H-DBD和pGADT7/HPV16E2DBD能在酵母菌中表達相應的目的蛋白；pet28a/Daxx能在E.coliBL21中表達融合蛋白6His-Daxx。 (2) HPV16E2蛋白能在細胞內外結合Daxx；HPV16E2通過N端結構域（TAD）與Daxx結合并發(fā)生相互作用。 (3)HPV16E2蛋白與Daxx主要分布于Caski細胞胞漿，且共定位胞漿與胞核。
[Abstract]:Objective: To study the interaction between human papillomavirus 16 (HPV16) E2 protein and Daxx, and to provide an experimental reference for further exploring the role and mechanism of two protein interactions in the carcinogenesis of HPV16.
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本文編號：1970794