本文選題：TLR配體 + 樹突狀細胞��； 參考：《浙江大學》2010年碩士論文

【摘要】： 目的 1.研究尖銳濕疣皮損中Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)各亞型的表達,以明確皮膚人乳頭瘤病毒(HPV)感染高相關性TLR亞型。 2.探討TLR配體——咪喹莫特、PIC(polyinosinicacid:polycytidylic acid)以及CpG oligonucleotide對人乳頭瘤病毒抗原肽-HPV11E7CTL表位肽(后簡稱“肽”)在小鼠模型中免疫應答的調節(jié)作用。 方法 1.將尖銳濕疣病人的病損組織標本冰凍切片經免疫組化染色檢測10種TLR亞型的表達情況,以正常皮膚組織作對照,比較兩者TLRs表達譜的差異。 2.提取小鼠骨髓樹突狀細胞(BM-DC),體外培養(yǎng)后先與HPV11E7CTL表位肽共孵育,再分別與咪喹莫特或PIC或CpG共孵育,以促進DC成熟,流式細胞儀檢測孵育后DC表面標志改變；體內實驗：將刺激成熟的DC分別注射于各組小鼠腹腔,以免疫小鼠,然后在小鼠皮下接種已轉染HPV11E7基因的B16腫瘤細胞；體外實驗：將HPV11E7CTL表位肽和TLR配體處理后的成熟DC與未經任何處理的小鼠脾細胞混合培養(yǎng)；ELISA法檢測小鼠脾臟T淋巴細胞培養(yǎng)液中細胞因子TNF-α和IFN-γ的濃度；乳酸脫氫酶(LDH)釋放法測定細胞毒性T淋巴細胞(CTL)活性；監(jiān)測小鼠皮下腫瘤大小以觀察DC免疫后對腫瘤的預防作用。 結果 1.正常表皮角質層和顆粒層TLR6、9呈強陽性表達,TLRR1、3、10呈中等度表達,TLR2、4、5、7、8弱表達,棘層和基底層細胞不表達或弱表達TLR；尖銳濕疣皮損表皮中除基底層弱表達或不表達TLR外,其余細胞層TLR1、3、6、9強陽性表達,TLR4、8、10中等度表達,TLR2、5、7弱表達。兩組的真皮層均未見明顯TLR陽性細胞。 2.BM-DC經與HPV11E7CTL表位肽及TLR配體共孵育后,反映其成熟度的表面標志CD40、CD80、CD86及MHC II (I-Ak)表型均明顯提高；肽加CpG處理組小鼠脾細胞分泌細胞因子TNF-α和IFN-γ的水平均為最高,且與對照組有明顯差異(P0.05)；各處理組小鼠腫瘤生長速度及脾臟T淋巴細胞的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)活性與對照組未見明顯差異。 結論 1.尖銳濕疣皮損增生的角質形成細胞中TLR表達較正常皮膚明顯增高,尤以TLR1、3、6、9亞型較顯著,可能與HPV感染啟動機體抗病毒免疫有關。 2.TLR激動劑尤其是CpG對小鼠模型中HPV11E7CTL表位肽所致的特異性免疫應答具有上調作用。
[Abstract]:objective
1. the expression of the Toll like receptor (Toll-like receptor, TLR) subtypes in the skin lesions of condyloma acuminata was studied to identify the high correlation TLR subtype of human papillomavirus (HPV) infection.
2. the effects of TLR ligand, imiquimod, PIC (polyinosinicacid:polycytidylic acid) and CpG oligonucleotide on the immune response of human papillomavirus antigenic peptide -HPV11E7CTL epitopes in mouse models, are investigated.
Method
1. the expression of 10 TLR subtypes was detected by immunohistochemical staining in the frozen section of the patients with condyloma acuminata, and the difference of TLRs expression profiles was compared between the normal skin tissues and the normal skin tissues.
2. the mouse bone marrow dendritic cells (BM-DC) were extracted and incubated with HPV11E7CTL epitope, then incubated with imiquimod or PIC or CpG respectively to promote the maturation of DC. The flow cytometry was used to detect the changes of the DC surface markers after incubation. In vivo experiment, the mature DC was injected into the abdominal cavity of mice in each group to immunize mice. B16 tumor cells transfected with HPV11E7 gene were inoculated subcutaneously in mice. In vitro, the mature DC treated with HPV11E7CTL epitope peptide and TLR ligand was mixed with the untreated mouse splenocytes; the concentration of cytokines TNF- A and IFN- in the mouse spleen T lymphocyte culture solution was detected by ELISA; lactate dehydrogenase (LDH) was detected. Release method was used to detect cytotoxic T lymphocyte (CTL) activity, and the size of subcutaneous tumor was monitored to observe the preventive effect of DC on tumor.
Result
1. the normal epidermal cuticle and granular layer TLR6,9 showed strong positive expression, TLRR1,3,10 was moderately expressed, TLR2,4,5,7,8 was weakly expressed, the spinous and basal layer cells did not express or weakly express TLR, and the TLR1,3,6,9 in the epidermis of condyloma acuminata was strongly expressed except for the weak expression of the basal layer or the non expression of TLR, and the TLR4,8,10 medium expression, TLR2. 5,7 was weakly expressed. No obvious TLR positive cells were found in the two groups of dermis.
After incubation with HPV11E7CTL epitopes and TLR ligands, 2.BM-DC reflected the surface marker of its maturity, CD40, CD80, CD86 and MHC II (I-Ak), and the level of TNF- alpha and IFN- gamma secreted by the peptiderma and CpG treatment group was the highest, and was significantly different from that in the irradiated group. The activity of cytotoxic T lymphocyte (CTL) in long - term and splenic T lymphocytes was not significantly different from that in the control group.
conclusion
1. the expression of TLR in keratinocytes of condyloma acuminate lesions was significantly higher than that of normal skin, especially TLR1,3,6,9 subtype, which may be related to the antiviral immunity of HPV infected body.
2.TLR agonist, especially CpG, has an up-regulated effect on the specific immune response induced by HPV11E7CTL epitope peptide in mouse models.
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392

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本文編號：1947781