發(fā)布時間：2018-05-25 18:41

  本文選題：弓形蟲 + 單克隆抗體�。� 參考：《河南農(nóng)業(yè)大學》2009年碩士論文

【摘要】：為建立弓形蟲病標準、準確、快速的免疫診斷體系及亞單位疫苗的研制,為弓形蟲抗原的分離和純化及探索弓形蟲的保護性免疫等研究提供適宜的工具,本研究利用經(jīng)淋巴細胞分離液密度梯度離心、微孔濾膜過濾、多次低速離心提純的弓形蟲速殖子,再通過反復凍融和超聲波處理后作為抗原免疫Balb/c小鼠6次,獲得針對弓形蟲速殖子的抗體。間接ELISA檢測結(jié)果顯示,6免后抗體效價均達到1：6400以上。 本次建立的間接ELISA方法,其主要條件如下：0.5μg·mL-1的弓形蟲速殖子為包被抗原,1%牛血清白蛋白為封閉劑,1：5000稀釋HRP標記羊抗鼠IgG作為二抗,TMB(3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯)作為底物。實驗證明,該方法特異性強,有較好的重復性。用該法對弓形蟲速殖子免疫小鼠的血清抗體及其雜交瘤細胞單抗上清進行檢測,獲得滿意的效果。 以PEG2000為促融劑,取效價高的免疫小鼠脾細胞與NSO骨髓瘤細胞融合。經(jīng)間接ELISA方法篩選陽性孔,有限稀釋法進行3-4次克隆和亞克隆,獲得4株能穩(wěn)定分泌抗弓形蟲單克隆抗體的雜交瘤細胞株(3A3、3G3、4F4、4G3),1株單抗腹水(3A3)。經(jīng)鑒定,4株雜交瘤細胞株的上清效價分別在1：800-12800之間,1株腹水(3A3)效價在1：51200,且穩(wěn)定性良好,單抗亞類為IgG1,與豬等孢子球蟲、豬隱孢子蟲、豬旋毛蟲、豬蛔蟲等無特異性。采用免疫熒光法對腹水進行初步鑒定,發(fā)現(xiàn)均為抗速殖子單抗。單抗的腹水提純后進行SDS-PAGE和Westen-blotting分析,單抗的分子量均約為45kDa。用3A3A5單抗包板酶標板與豬抗弓形蟲抗體建立夾心ELISA方法,單抗的最佳稀釋度為1：800,豬抗弓形蟲高免血清的最佳稀釋度為1：100-200。特異性試驗表明：該方法對于同屬于孢子蟲屬的豬等孢子球蟲、豬隱孢子蟲、豬旋毛蟲、豬蛔蟲有較高的識別力,其OD450nm值則顯著偏低。該方法不受其它外界因素的影響,靈敏度高,特異性強,對于臨床診斷和公共衛(wèi)生學將是一種簡便、可靠的檢測方法,為下一步建立弓形蟲病快速診斷體系奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:In order to establish the standard of Toxoplasma gondii disease, accurate and rapid immune diagnosis system and the development of subunit vaccine, to provide a suitable tool for the isolation and purification of Toxoplasma antigen and the exploration of protective immunity of Toxoplasma gondii. In this study, Toxoplasma gondii Tachyzoites were purified by density gradient centrifugation, microporous membrane filtration and low speed centrifugation. Balb/c mice were immunized with Toxoplasma gondii Tachyzoites as antigens after repeated freezing and thawing and ultrasonic wave treatment. Antibody against Toxoplasma gondii tachyzoites was obtained. The results of indirect ELISA showed that the titers of antibodies were above 1: 6400. The main conditions of the indirect ELISA method were as follows: Toxoplasma gondii Tachyzoites of 0.5 渭 g / mL-1 were coated with 1% bovine serum albumin (BSA) as an encapsulated antigen, and 1: 5000 diluted HRP labeled sheep anti-mouse IgG as the second antibody TMB3 / 3 (5 / 5) -tetramethyl biphenyls (TMB) as the substrate of Toxoplasma gondii Toxoplasma gondii Tachyzoites (Toxoplasma gondii). Experimental results show that the method is specific and reproducible. The serum antibody and its monoclonal antibody supernatant of mice immunized with Toxoplasma gondii tachyzoites were determined by this method and satisfactory results were obtained. The spleen cells of immunized mice with high titer were fused with NSO myeloma cells using PEG2000 as a fusion agent. Four hybridoma cell lines capable of stably secreting monoclonal antibodies against Toxoplasma gondii were obtained by indirect ELISA screening and limited dilution method for 3-4 times and subclones, and 4 hybridoma cell lines with stable secretion of monoclonal antibodies against Toxoplasma gondii (Toxoplasma gondii) were obtained. The supernatant titers of four hybridoma cell lines were from 1: 800-12800 to 1: 800-12800, respectively. The titer of ascitic cell strain 3A3 was 1: 51200.The Monoclonal subclass was IgG1, which had no specificity with Isosporidium, Cryptosporidium suis, Trichinella spiralis and Ascaris suis. Immunofluorescence assay was used to identify ascites and all of them were identified as anti-tachyzoite monoclonal antibodies. SDS-PAGE and Westen-blotting analysis showed that the molecular weight of McAb was about 45kDa. The sandwich ELISA method was established by using 3A3A5 McAb envelope plate and porcine anti-toxoplasma antibody. The optimal dilution of the McAb was 1: 800, and the optimal dilution of porcine anti-Toxoplasma high immunity serum was 1: 100-200. The specificity test showed that the method had high recognition ability for isosporidium, cryptosporidium, trichinella and Ascaris suis belonging to the same genus of sporidium, and its OD450nm value was significantly lower. This method is not affected by other external factors and has high sensitivity and specificity. It will be a simple and reliable method for clinical diagnosis and public health. It will lay a foundation for establishing a rapid diagnosis system for Toxoplasma gondii in the next step.
【學位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392

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本文編號：1934256