本文選題：樹突狀細胞 + Fas��； 參考：《第二軍醫(yī)大學》2010年博士論文

【摘要】： Fas(CD95/Apo-1)屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族,一旦和其配體FasL或者活化性抗體相互作用后便能夠觸發(fā)細胞的凋亡。Fas介導的細胞凋亡在維持腦、眼睛和睪丸器官的免疫自穩(wěn)和免疫豁免中起著至關重要的作用。Fas介導的細胞凋亡既往被認為是一個非炎癥性的過程,能夠引起免疫反應和炎癥反應的消退。然而,越來越多的實驗表明Fas也能夠啟動觸發(fā)增殖性的和活化性的信號來促進炎癥反應。已有報告顯示,Fas信號能夠引起一些趨化性細胞因子和炎性細胞因子的分泌。例如,Fas信號能夠引起樹突狀細胞(dendritic cells, DCs)、早期人胎星形膠質細胞(early passage fetal human astrocytes)和人血管平滑肌細胞分泌趨化性細胞因子。而且,Fas信號也能促進巨噬細胞、纖維母細胞、上皮細胞和滑膜細胞分泌炎性細胞因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα, TNF-α)、IL-6和IL-8。另外,Fas信號也能引起關鍵性炎性細胞因子IL-1β的分泌,但其機制尚不清楚。 與其他炎癥性細胞因子不同的是,IL-1p是以前體的形式存在于細胞漿中的,其被Caspase-1加工、剪接后方能成為有活性的成熟形式。IL-18和IL-33也需要經過Caspase-1的加工、剪接才能成為有活性的成熟形式。最近幾年的大量研究表明Caspase-1的活化需要一個稱為炎性復合體(inflammasome)的分子復合物的參與。炎性復合體能識別特定的配體包括MDP (muramyl dipeptide)、ATP和尿酸,最終導致分子復合物構象改變和Caspase-1的激活。危險信號分子ATP受到關注較多,它能夠結合P2X7R (purinergic P2X7 receptor)而激活NALP3炎性復合體。NLR(NOD-like receptor)家族成員包括NALP3、NALP1或IPAF參與識別危險信號以及PAMP (pathogen-associated molecular pattern)。 DCs是體內已知的效能最強的抗原提呈細胞,在啟動免疫應答的過程中起著至關重要的作用。多個研究表明,DCs細胞表面表達Fas但抵抗Fas介導的凋亡,而且不依賴于它們的成熟狀態(tài)。這可能和DCs高表達凋亡抵抗蛋白FLIP(FLICE-inhibitory protein)相關。我們實驗室以往的研究也證明Fas信號作用于DCs后誘導了DCs的成熟和存活。因此,Fas信號在DCs中觸發(fā)了不同于經典凋亡途徑的信號轉導,其不誘導DCs凋亡可能對于DCs在體內免疫應答啟動的關鍵步驟即抗原提呈中發(fā)揮重要作用是有益的,但是,對于其詳細的作用機制仍不甚了解。 我們實驗室以往的研究顯示Fas信號能夠誘導DCs分泌IL-1β,這提示我們Fas信號可能和炎性復合體存在關聯。在本研究中,我們發(fā)現Fas的活化性抗體Jo-2作用于DCs后,引起內源性的ATP釋放。釋放的ATP以自分泌的方式作用于DCs細胞表面的P2X7R,觸發(fā)胞內信號轉導引起NALP3炎性復合體的激活,最終導致 Caspase-1的活化、IL-1β的加工剪接與分泌,導致DCs的成熟與活化。 1.Fas信號通過激活NALP3炎性復合體而誘導DCs分泌IL-1β 為詳細全面地研究Fas信號對DCs功能的影響,我們首先檢測了Fas信號是否誘導DCs的凋亡。在我們的試驗體系中,我們使用Fas的活化性抗體Jo-2作用于經CD11c磁珠陽性分選過的DCs。與以前的報道結果一樣,我們發(fā)現imDCs(immatureDCs)和mDCs(mature DCs)均對Fas介導的細胞凋亡不敏感,高濃度的Jo-2作用24h也不能誘導DCs的凋亡。而作為陽性對照的胸腺細胞對Jo-2誘導的凋亡很敏感,并且Fas缺陷小鼠來源的胸腺細胞對Jo-2誘導的細胞凋亡表現為抵抗。這說明與胸腺細胞不同,小鼠來源的DCs無論成熟狀態(tài)與否均對Fas介導的細胞凋亡不敏感。 接著我們觀察了Jo-2對DCs分泌細胞因子的影響。結果發(fā)現Jo-2不能誘導炎性細胞因子TNF-α和IL-6的分泌,但能夠特異性地誘導IL-1β的分泌,對照抗體對細胞因子分泌沒有任何影響,FasL誘導細胞因子分泌的效應和Jo-2相似。Jo-2誘導的IL-1β分泌可以被Caspase-1特異性的抑制劑YVAD所抑制。我們利用Westernblot的方法證實了Jo-2作用于DCs后可以引起Caspase-1的活化,由于Caspase-1的活化是炎性復合體激活的標志,這提示Fas信號和炎性復合體相關聯。有趣的是,我們發(fā)現DCs用LPS處理16h后再用Jo-2刺激6h可以更加顯著地增強IL-1β的分泌,并且Jo-2的此種增強效應可以被Caspase-1特異性的抑制劑YVAD或者ATP通道拮抗劑oATP所抑制。眾所周知,LPS可以顯著促進NALP3炎性復合體前體成分的合成,Jo-2的這種顯著增強LPS處理過DCs分泌IL-1β的效應顯然和炎性復合體的活化有關并且和ATP密切關聯。 為了進一步明確Fas信號和炎性復合體的關系,我們利用實時定量PCR的方法檢測了Jo-2對炎性復合體成分表達的影響。結果發(fā)現,Jo-2可以明顯促進NALP3炎性復合體中NALP3和IL-1β的表達,而對ASC和Caspase-1的表達沒有影響。而且Jo-2誘導的NALP3和IL-1βmRNA的表達可以被NF-κB特異性抑制劑PDTC所抑制,這提示Jo-2通過活化NF-κB信號通路來促進炎性復合體相關成分的表達。我們利用Western blot的方法證實了Jo-2作用于DCs后可以引起NF-κB上游抑制蛋白IκB的磷酸化以及降解,這就導致NF-κB與IκB的解離,并使得NF-κB進入細胞核中與相應的靶序列結合促進基因的表達。為了進一步明確Fas信號與NALP3炎性復合體的關系,我們利用基因沉默的方法干擾NALP3炎性復合體相關成分的表達,然后觀察Jo-2誘導的IL-1β分泌是否依賴于NALP3炎性復合體。結果發(fā)現,用siRNA干擾NALP3炎性復合體的表達后,LPS和Jo-2誘導的IL-1β分泌受到明顯的抑制。表明Fas信號誘導的IL-1β分泌是通過NALP3炎性復合體來實現的。 2.Fas信號通過促進內源性ATP的釋放而激活NALP3炎性復合體 由于我們的試驗結果提示Jo-2誘導的IL-1β分泌和ATP相關,因此我們進一步·用報告基因的方法檢測了Fas信號對ATP分泌的影響。結果發(fā)現LPS能夠引起ATP的釋放,而FasL或Jo-2刺激能夠引起大量的ATP釋放,pan Caspase抑制劑zVAD對Jo-2引起的ATP分泌沒有影響,但ATP酶的抑制劑ARL能夠增強Jo-2引起的ATP分泌一倍左右。這提示Jo-2能夠引起內源性的ATP釋放,并和細胞死亡沒有關聯。相應的,我們也發(fā)現LPS和Jo-2能夠IL-1p的分泌,并且被pan Caspase抑制劑zVAD抑制,這可能和Caspase-1活化受抑制有關。而ARL相應的增強IL-1β的產生。LDH釋放結果顯示LPS和Jo-2不能引起LDH的釋放,以上結果提示Jo-2在不影響細胞存活的情況下能夠特異性誘導細胞內源性的ATP釋放。 胞外的ATP作用于細胞表面的P2X7R后能夠觸發(fā)細胞內的信號轉導通路,最終引起NALP3炎性復合體的活化。我們接下來研究了P2X7R在Fas信號誘導IL-1β分泌中的作用。我們發(fā)現預處理P2X7R抑制劑后,Jo-2誘導的IL-1p分泌受到明顯的抑制,同時伴隨著DCs的成熟(lab,CD86)也受到抑制。我們通過試驗證實了IL-1β在Jo-2誘導的DCs成熟中起著至關重要的作用,而P2X7R抑制劑即是通過抑制IL-1β分泌來影響Jo-2誘導的DCs成熟。 接下來我們研究了ATP作用于DCs后引起的細胞信號通路變化。我們通過Western blot的方法證實了Jo-2作用于DCs后可以引起ERK信號通路顯著活化。而給予P2X7R抑制劑后能夠劑量依賴性的降低Jo-2引起的ERK信號通路的活化以及Caspase-1的活化,這提示ATP信號作用于ERK和Caspase-1的上游。另外,給予ERK信號通路抑制劑PD98059能劑量依賴性的抑制ERK以及Caspase-1的活化,可見ERK信號作用于Caspase-1的上游。相應的PD98059和Caspase-1特異性的抑制劑YVAD能夠特異性的抑制IL-1β的分泌和DCs的成熟。綜上,ATP-P2X7R-ERK-Caspase-1通路在Fas信號誘導DCs分泌IL-1β以及由其引起的DCs成熟中發(fā)揮著至關重要的作用。 3.Fas信號通過誘導內源性ATP釋放和IL-1β產生而參與DC激活T細胞的作用 體內ATP的來源一直不是很清楚,因為ATP一旦分泌到細胞外便被胞外的ATP酶迅速降解,其濃度受到嚴格的控制。由于我們發(fā)現Fas信號可以促進大量ATP的釋放,而DC-T相互作用時也有FasL-Fas之間的相互作用,因此我們推測在DC-T相互作用時可能會引起大量ATP的釋放并參與DC-T相互作用。 我們在抗原肽特異性T細胞增殖體系中研究了DC-T相互作用時ATP可能起的作用。我們在DC-T共培養(yǎng)體系中加入了P2X7R抑制劑KN-62以及ATP酶apyrase,培養(yǎng)48h后檢測上清中IL-1β的水平。結果發(fā)現KN-62和apyrase能夠明顯抑制IL-1β的分泌,提示在DC-T相互作用時ATP參與IL-1β的產生。另外,KN-62和apyrase也明顯抑制了IL-2和IFN-7的分泌,而且KN-62的抑制效應可以被外源性的重組IL-1β部分逆轉。更為重要的是,KN-62和apyrase也能夠明顯抑制抗原肽特異性的T細胞增殖,而外源性的重組IL-1β可以部分逆轉KN-62的抑制效應。這些結果提示ATP參與調控了DC-T相互作用時IL-1β的產生,并間接性的影響其它細胞因子的分泌,最終影響了抗原肽特異性的T細胞的增殖。為了更直接的證明在DC刺激T細胞增殖時有ATP存在與參與,我們用報告基因的方法檢測了DC-T培養(yǎng)上清中ATP的分泌情況。結果發(fā)現,在抗原肽存在的條件下,一旦DCs和T細胞共孵育,上清中ATP的濃度迅速增高,在第四個小時達到高峰(約100nM),然后迅速回落,維持在50nM左右的水平達40個小時以上。DCs的Fas缺陷對ATP分泌的高峰沒有影響,但在維持后期ATP的濃度時發(fā)揮重要作用。另外,培養(yǎng)上清中的LDH沒有觀察到明顯的釋放�？梢�,在DCs刺激T細胞增殖時有高濃度的ATP存在并發(fā)揮重要作用,而DCs的Fas信號在ATP的釋放中也起關鍵作用。 綜上所述,Fas信號可以通過促進DCs內源性ATP的釋放從而觸發(fā)ATP-P2X7R-ERK-Caspase-1-IL-1β通路導致IL-1β的成熟、釋放,釋放后的IL-1β可以以自分泌的方式作用于DCs本身促進DCs的成熟與活化,最終促進抗原特異性T細胞的增殖。本研究發(fā)現了Fas信號參與炎癥反應的直接證據,對于DCs參與免疫調控提出了新的學術觀點,將有助于更好地理解FasL-Fas系統(tǒng)與炎癥之間錯綜復雜的關系以及為某些炎癥性臨床疾病發(fā)病機制的研究提供了理論基礎,也為相關疾病的治療提供了潛在的靶標。
[Abstract]:Fas ( CD95 / Apo - 1 ) belongs to the superfamily of tumor necrosis factor ( TNF ) receptors and can trigger apoptosis of cells after interaction with its ligand FasL or activated antibody . Fas - mediated apoptosis plays a crucial role in maintaining immune homeostasis and immune immunity of brain , eye and testis organs . However , it has been shown that the Fas signal can trigger inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor 偽 ( TNF - 偽 ) , IL - 6 and IL - 8 . The Fas signal can also induce the secretion of inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor 偽 ( TNF - 偽 ) , IL - 6 and IL - 8 .



IL - 18 and IL - 33 are involved in the activation of caspase - 1 . IL - 18 and IL - 33 also need to be processed by Caspase - 1 . IL - 18 and IL - 33 also need to be involved in the activation of the active mature form . The inflammatory complex can recognize that the activation of Caspase - 1 requires the activation of a molecule complex known as an inflammatory complex . A large number of studies have shown that the activation of Caspase - 1 requires the activation of a molecule complex known as an inflammatory complex . A large number of studies in recent years have shown that activation of the NALP3 inflammatory complex is required by the activation of an NALP3 , NALP1 or IPAF , and the NALP3 , NALP1 or IPAF is involved in the identification of the risk signal and the PAMP ( pathogen - associated molecular pattern ) .



DCs are the most potent antigen - presenting cells known in vivo and play a crucial role in the initiation of immune responses . Several studies have shown that the expression of Fas on DCs induces apoptosis in DCs and does not depend on their maturation .



In our study , we found that the expression of Fas signal can induce the secretion of IL - 1尾in DCs , which suggests that the Fas signal may be associated with inflammatory complex . In this study , we find that the activation antibody Jo - 2 of Fas acts on DCs , which causes endogenous ATP release . The released ATP acts on the surface of DCs in self - secretion , triggering intracellular signal transduction to induce the activation of NALP3 inflammatory complex , which ultimately leads to the activation of the NALP3 inflammatory complex .



The activation of Caspase - 1 , the processing of IL - 1尾 and the secretion of IL - 1尾 result in maturation and activation of DCs .



1 . The Fas signal induces DCs to secrete IL - 1beta by activating the NALP3 inflammatory complex .



In order to investigate the effect of Fas signal on the function of DCs in detail , we first examined whether the Fas signal induced apoptosis of DCs . In our trial system , we found that both imDCs and mDCs were insensitive to Fas - mediated apoptosis .



The results showed that Jo - 2 could not induce the secretion of TNF - 偽 and IL - 6 , but it could induce the secretion of IL - 1尾 . The effect of Jo - 2 on the secretion of IL - 1尾could be enhanced by the activation of Caspase - 1 . The effect of Jo - 2 on the secretion of IL - 1尾could be significantly enhanced by the activation of Caspase - 2 . The effect of Jo - 2 on IL - 1尾 secretion was obviously related to activation of inflammatory complex and was closely associated with ATP .



In order to further clarify the relationship between the expression of NALP3 and IL - 1尾in NALP3 , the expression of NALP3 and IL - 1尾in NALP3 was significantly promoted by the method of real - time quantitative PCR .



2 . Fas signal activates NALP3 inflammatory complex by promoting release of endogenous ATP



We also found that LPS and Jo - 2 were able to induce ATP release .



We found that the secretion of IL - 1尾induced by Jo - 2 was significantly inhibited and the maturation of IL - 1尾was inhibited by inhibiting IL - 1尾secretion .



In addition , the ERK signal pathway inhibitor PD98059 can inhibit the activation of ERK signal pathway and the activation of Caspase - 1 . It is suggested that the ERK signal pathway inhibitor PD98059 can inhibit the secretion of IL - 1尾and the maturation of DCs .



3 . Fas signal is involved in DC - activated T cells by inducing endogenous ATP release and IL - 1尾 production



The source of ATP in vivo has not been clear since ATP is rapidly degraded by extracellular ATP once secreted outside of the cell , and its concentration is tightly controlled . As we find that the Fas signal can promote the release of a large amount of ATP , and the interaction between FasL - Fas in the DC - T interaction , we suggest that a large amount of ATP can be released and involved in the DC - T interaction at the time of the DC - T interaction .



It was found that the presence and absence of ATP involved in the production of IL - 1尾in DC - T co - culture system . The results suggested that KN - 62 and apytosis could significantly inhibit the secretion of IL - 1尾 . The results suggested that KN - 62 and apytosis could significantly inhibit the secretion of IL - 1尾 . In addition , KN - 62 and apytosis could significantly inhibit the secretion of IL - 1尾. In addition , KN - 62 and apytosis could significantly inhibit the secretion of IL - 1尾 .



In conclusion , the expression of Fas signal can trigger the maturation , release and release of IL - 1beta by promoting the release of endogenous ATP in DCs . The direct evidence of the involvement of the Fas signal in DCs per se can promote the maturation and activation of DCs . It is helpful to understand the complex relationship between FasL - Fas system and inflammation and provide a theoretical basis for the study of pathogenesis of certain inflammatory clinical diseases , and also provides a potential target for the treatment of related diseases .
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392

【共引文獻】

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本文編號：1907136