本文選題：PIG11 + miRNA��； 參考：《南華大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 目的:構(gòu)建人PIG11的miRNA表達(dá)載體pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR,建立低表達(dá)PIG11基因的HepG2細(xì)胞株,聯(lián)合采用本課題組前期已建立的PIG11蛋白穩(wěn)定高表達(dá)HepG2細(xì)胞株,探討PIG11蛋白表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響,以及ROS和Survivin、Caspase3、Caspase9蛋白表達(dá)在凋亡過程中的作用。闡明PIG11誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。 方法:構(gòu)建4個(gè)miRNA表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)菌DH5α挑取克隆測(cè)序。在脂質(zhì)體2000的協(xié)助下轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,經(jīng)BSD篩選,獲得穩(wěn)定PIG11蛋白低表達(dá)的HepG2細(xì)胞。RT-PCR和Western Blot分別從mRNA和蛋白質(zhì)水平鑒定4組載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后PIG11的表達(dá)情況,從中選取干擾效果最好的1組作為PIG11蛋白低表達(dá)的HepG2細(xì)胞模型。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)分組為HepG2細(xì)胞、pLXSN-HepG2細(xì)胞(空載體組細(xì)胞)、pLXSN-PIG11-HepG2細(xì)胞(PIG11高表達(dá)組細(xì)胞)、miR-PIG11-HepG2細(xì)胞(PIG11低表達(dá)組細(xì)胞)、miR-NC-HepG2細(xì)胞(干擾錯(cuò)義序列組細(xì)胞)。利用MTT法和平皿克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況;PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其凋亡效應(yīng);DCFH-DA熒光探針標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)ROS,流式檢測(cè)ROS水平的改變;Western Blot測(cè)定Survivin、Caspase3、Caspase9蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果:成功構(gòu)建4組人PIG11的miRNA表達(dá)載體pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR,基因測(cè)序正確。轉(zhuǎn)染后獲得穩(wěn)定細(xì)胞株,測(cè)定結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染第4組干擾質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞PIG11 mRNA水平最低(p0.01),PIG11蛋白表達(dá)最低(p0.01)。實(shí)驗(yàn)顯示:pLXSN-PIG11-HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)減慢(p0.01),miR-PIG11-HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)加快(p0.01),pLXSN-HepG2細(xì)胞、miR-NC-HepG2細(xì)胞、HepG2細(xì)胞各組間生長(zhǎng)差異無顯著性。 結(jié)果顯示:HepG2細(xì)胞、pLXSN-HepG2細(xì)胞、pLXSN-PIG11-HepG2細(xì)胞、miR-PIG11-HepG2細(xì)胞、miR-NC-HepG2細(xì)胞的凋亡率分別為5.72%±0.81、5.34%±0.60、34.83%±2.29、1.34%±0.71、5.10%±0.40。pLXSN-PIG11-HepG2細(xì)胞凋亡率比其它各組增高(p0.01),miR-PIG11-HepG2細(xì)胞凋亡率降低(p0.01)。 HepG2細(xì)胞、pLXSN-HepG2細(xì)胞、pLXSN-PIG11-HepG2細(xì)胞、miR-PIG11-HepG2細(xì)胞、miR-NC-HepG2細(xì)胞的ROS水平分別為5.52±0.97、4.92±0.71、15.71±0.82、2.39±0.22、5.12±0.15,pLXSN-PIG11-HepG2細(xì)胞ROS水平高于其余各組(p0.05),miR-PIG11-HepG2細(xì)胞ROS水平低于其余各組(p0.05)。使用ROS清除劑NAC后,各組細(xì)胞內(nèi)的ROS水平降低,流式凋亡檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡顯示pLXSN-PIG11-HepG2細(xì)胞凋亡率為16.2%±1.18較原來降低(p0.05),余各組細(xì)胞凋亡率變化不明顯。使用MPTP抑制劑CsA后, pLXSN-PIG11-HepG2細(xì)胞組ROS水平降低至8.12±0.92(p0.05),余各組細(xì)胞變化不明顯。 pLXSN-PIG11-HepG2細(xì)胞中Caspase3、Caspase9蛋白表達(dá)上調(diào)(p0.01),Survivin蛋白表達(dá)下調(diào)(p0.01),miR-PIG11 -HepG2細(xì)胞中Caspase3、Caspase9蛋白表達(dá)下調(diào)(p0.01),Survivin蛋白表達(dá)上調(diào)(p0.01)。 結(jié)論:建立了PIG11低表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞模型;PIG11高表達(dá)能抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)其凋亡;PIG11誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與胞內(nèi)ROS變化和Caspase3,9蛋白表達(dá)上調(diào)及Survivin蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)。
[Abstract]:Objective: to construct a miRNA expression vector of human PIG11, pcDNA? 6.2-GW/EmGFPmiR, to establish a HepG2 cell line with low expression of PIG11 gene, and to combine the stable and high expression of HepG2 cell lines with the previously established PIG11 protein in our group, and to explore the effect of PIG11 protein expression on the apoptosis of HepG2 cells, as well as ROS and Survivin, and the expression of the protein in the apoptosis of HepG2 cells. The role of PIG11 in inducing apoptosis is elucidated.
Methods: 4 miRNA expression plasmids were constructed and converted to DH5 alpha of receptive bacteria to clone and sequence. HepG2 cells were transfected under the assistance of liposome 2000. The expression of.RT-PCR and Western Blot, a HepG2 cell with low expression of PIG11 protein, was obtained, and the expression of PIG11 was identified from mRNA and protein levels, respectively, from mRNA and protein levels. The 1 groups with the best interference effect were selected as the HepG2 cell model with low expression of PIG11 protein, so the follow-up experiments were divided into HepG2 cells, pLXSN-HepG2 cells (unloaded group cells), pLXSN-PIG11-HepG2 cells (PIG11 high expression group cells), miR-PIG11-HepG2 cells (PIG11 low expression group cells), miR-NC-HepG2 cells (interfering missense sequence group fine) The cell growth of the cells was detected by the MTT method, and the apoptosis effect was detected by PI staining flow cytometry; the DCFH-DA fluorescence probe marked the intracellular ROS, the flow cytometry was used to detect the changes of ROS level; Western Blot was used to determine the expression of Survivin, Caspase3, Caspase9 protein.
Results: the miRNA expression vector pcDNA? 6.2-GW/EmGFPmiR of 4 groups of human PIG11 was successfully constructed, and the gene was sequenced correctly. The stable cell line was obtained after transfection. The results showed that the PIG11 mRNA level of HepG2 cells transfected with fourth groups of plasmids was the lowest (P0.01), and the expression of PIG11 protein was the lowest (P0.01). The experiment showed that pLXSN-PIG11-HepG2 cell growth slowed (P0.01), The growth of R-PIG11-HepG2 cells was accelerated (P0.01), but there was no significant difference in the growth of pLXSN-HepG2 cells, miR-NC-HepG2 cells and HepG2 cells.
The results showed that the apoptosis rates of HepG2 cells, pLXSN-HepG2 cells, pLXSN-PIG11-HepG2 cells, miR-PIG11-HepG2 cells and miR-NC-HepG2 cells were 5.72% + 0.81,5.34% + 0.60,34.83% + 2.29,1.34% + 0.71,5.10% + 0.40.pLXSN-PIG11-HepG2 cells (P0.01), and the apoptosis rate of miR-PIG11-HepG2 cells decreased.
The ROS levels of HepG2 cells, pLXSN-HepG2 cells, pLXSN-PIG11-HepG2 cells, miR-PIG11-HepG2 cells and miR-NC-HepG2 cells were 5.52 + 0.97,4.92 + 0.71,15.71 + 0.82,2.39 + 0.22,5.12 + 0.15 respectively. PLXSN-PIG11-HepG2 cell ROS level was higher than that of the rest of the other groups. After the removal of NAC, the level of ROS in each group decreased. Apoptosis in each group showed that the apoptosis rate of pLXSN-PIG11-HepG2 cells was 16.2% + 1.18 than that of the original (P0.05), and the apoptosis rate of the remaining groups was not obvious. After CsA, the ROS level of the pLXSN-PIG11-HepG2 cell group decreased to 8.12 + 0.92 (P0.05), and the remaining groups were fine. The change of cell was not obvious.
In pLXSN-PIG11-HepG2 cells, the expression of Caspase3, Caspase9 protein was up regulated (P0.01), the expression of Survivin protein was downregulated (P0.01), Caspase3 in miR-PIG11 -HepG2 cells, down regulation of Caspase9 protein expression (P0.01), and up regulation of Survivin protein expression.
Conclusion: a stable cell model of low expression of PIG11 is established. High expression of PIG11 can inhibit the growth and induce apoptosis of HepG2 cells. PIG11 induced apoptosis is related to the changes in intracellular ROS, up regulation of Caspase3,9 protein expression and down regulation of the expression of Survivin protein.
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：1903888