本文選題：ALT1 + 原核表達(dá)　； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2009年碩士論文

【摘要】： 人Ⅰ型丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶是人體內(nèi)一種以磷酸吡哆醛為輔基的氨基轉(zhuǎn)移酶,在體內(nèi)催化氨基在丙氨酸和谷氨酸之間轉(zhuǎn)移,在非必需氨基酸的合成和蛋白質(zhì)分解代謝中起重要的中介作用。臨床上ALT是反應(yīng)肝臟功能的有效指標(biāo)。血清中ALT的活性可有意義地評估由感染、藥物、酒精及脂肪變性等原因而引起的肝臟損害,對肝臟疾病的診斷,鑒別診斷及病情和療效的監(jiān)測方面發(fā)揮著重要作用。目前,ALT在臨床上的檢測方法是利用血清中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶,在一定條件下催化底物L(fēng)-丙氨酸與α-酮戊二酸生成L-谷氨酸和L-丙酮酸,再針對該反應(yīng)產(chǎn)物偶聯(lián)一個指示反應(yīng),計算出ALT酶活性濃度。此類方法檢測的均是ALT酶活性濃度而不是血清中ALT的質(zhì)量濃度。酶活性測定方法影響因素多,易受底物濃度、酶蛋白抑制劑、離子強(qiáng)度、pH、溫度等多種因素的影響,同時不能有效區(qū)分不同的同功酶,因此有必要建立特異的免疫學(xué)方法來監(jiān)測血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶中實際質(zhì)量,從而更加真實客觀地反應(yīng)肝臟功能的損害程度。 目的: 構(gòu)建人Ⅰ型丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT1)的原核表達(dá)載體,用純化的ALT1重組蛋白免疫新西蘭大白兔,制備抗ALT1多克隆抗體,同時用純化的ALT1重組蛋白免疫Balb/c小鼠,制備特異性針對ALT1的單克隆抗體,為進(jìn)一步建立ALT1的免疫學(xué)診斷方法和研究ALT1的生物學(xué)作用和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法: 1.采用RT-PCR法擴(kuò)增ALT1基因片段,并將其分別克隆到原核表達(dá)載體pET32a(+)和pGEX-4T-2,構(gòu)建人Ⅰ型丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT1)的原核表達(dá)載體。 2.將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),對表達(dá)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析和Western Blot檢測,采用親和層析純化融合蛋白。 3.用純化的ALT1重組蛋白免疫新西蘭大白兔,制備抗ALT1的多克隆抗體。 4.用純化的ALT1重組蛋白免疫Balb/c小鼠,制備特異性針對ALT1的單克隆抗體。 結(jié)果: 1.用RT-PCR方法擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的目的基因片段,目的基因與載體連接后的重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定及測序分析證實重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。 2.經(jīng)重組表達(dá)純化,獲得了ALT1融合蛋白,其在pET32a(+)/ALT1表達(dá)載體中表達(dá)形式為不溶性包涵體,在pGEX-4T-2/ALT1載體中有少部份以可溶性形式表達(dá),融合蛋白均能通過親和層析的方法純化。 3.用純化的ALT1重組蛋白免疫新西蘭大白兔,可制備出特異性針對ALT1的多克隆抗體。 4.用純化的ALT1可溶性重組蛋白免疫Balb/c小鼠,建立了穩(wěn)定分泌抗ALT1的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,命名為8A9。其抗體亞類為IgG2;將8A9細(xì)胞株接種到預(yù)處理的Balb/c小鼠腹腔中制備腹水型ALT1單克隆抗體,酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)證明腹水效價可達(dá)105; Western Blot結(jié)果鑒定提示該單克隆抗體可以特異性結(jié)合ALT1。 結(jié)論: 經(jīng)基因重組技術(shù)獲得ALT1融合蛋白,并對其進(jìn)行了純化,制備了特異性針對ALT1的多克隆和單克隆抗體。為我們進(jìn)一步探討ALT1的生物學(xué)功能及其開發(fā)特異性針對ALT1免疫學(xué)方法奠定了堅實的基礎(chǔ)。
[Abstract]:Human type 鈪，

本文編號：1896058