發(fā)布時(shí)間：2018-05-12 23:43

  本文選題：WNK4 + 基因表達(dá)��； 參考：《中國(guó)醫(yī)科大學(xué)》2008年碩士論文

【摘要】： 前言 WNK4(with no lysine[K]kinase-4)基因是新近分離克隆的一個(gè)蛋白激酶基因,該基因第7外顯子(exon7)和第17外顯子(exon17)突變可導(dǎo)致常染色體顯性遺傳性疾病,假性低醛固酮血癥(Pseudohypoaldosteronism typeⅡ,PHAⅡ)。研究表明WNK4可以作用于腎臟遠(yuǎn)曲小管和集合管上的離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(Na-Cl共轉(zhuǎn)運(yùn)體,NCCT)和離子通道(鉀離子通道,ROMK),從而起到對(duì)血壓和離子平衡的調(diào)控作用。目前大量的研究集中在探索WNK4基因的功能上,但WNK4基因的上游調(diào)控因子仍不清楚。 乙�；诙喾N基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用,兩類作用相反的酶,組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)和組蛋白去乙�；�(HDAC)參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)乙�；癄顟B(tài)。曲古抑菌素A(TSA)能夠特異性抑制HDAC活性從而引起組蛋白和一些轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子的乙酰化。迄今為止尚無有關(guān)乙�；瘜�(duì)WNK4基因表達(dá)調(diào)控的研究。 本研究以TSA作為乙�；饔靡蛩�,探索乙�；瘜�(duì)人胚腎HEK293細(xì)胞中WNK4基因rnRNA和蛋白表達(dá)水平的影響,并鑒定WNK4啟動(dòng)子區(qū)的GATA-1反應(yīng)元件及TSA對(duì)GATA-1蛋白乙�；郊癉NA親和力和WNK4啟動(dòng)子活性的影響,從而探索乙�；{(diào)節(jié)WNK4基因表達(dá)的機(jī)制。 材料與方法 一、實(shí)驗(yàn)材料 1、人胚腎HEK293細(xì)胞系 2、胚胎(胎齡22周)腎臟組織標(biāo)本 3、Real-time PCR及Western印跡雜交相關(guān)試劑 4、基因克隆及螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)相關(guān)分子生物學(xué)試劑 5、電泳泳動(dòng)遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)、染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)及免疫沉淀(IP)相關(guān)試劑 二、實(shí)驗(yàn)方法 1、Real-time RT-PCR檢測(cè)TSA刺激前后WNK4 mRNA表達(dá)水平的變化。 2、Western印跡雜交檢測(cè)TSA對(duì)WNK4蛋白表達(dá)水平的影響。 3、應(yīng)用軟件及螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析WNK4啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)。 4、RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GATA-1mRNA在HEK293細(xì)胞及胚胎腎臟組織中的表達(dá)。 5、EMSA及ChIP鑒定WNK4啟動(dòng)子內(nèi)GATA-1反應(yīng)元件及TSA對(duì)GATA-1蛋白與該位點(diǎn)結(jié)合力的影響。 6、免疫沉淀結(jié)合Western印跡雜交檢測(cè)TSA對(duì)GATA-1蛋白乙�；降挠绊�。 7、螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)GATA-1反應(yīng)元件在TSA對(duì)WNK4啟動(dòng)子活性影響中的作用。 結(jié)果 1、Real-time RT-PCR結(jié)果顯示TSA以濃度依賴方式上調(diào)WNK4 mRNA表達(dá)水平。 2、Western印跡雜交表明TSA誘導(dǎo)的乙酰化使HEK293細(xì)胞中WNK4蛋白水平顯著增加。 3、軟件分析及螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)在WNK4啟動(dòng)子內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一些潛在的受乙�；{(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。 4、RT-PCR的結(jié)果提示GATA-1 mRNA在HEK293細(xì)胞及胚胎腎臟組織中有明顯的表達(dá)。 5、EMSA及ChIP實(shí)驗(yàn)在分別在體外及體內(nèi)條件下證明了WNK4啟動(dòng)子-426～-416區(qū)為GATA-1反應(yīng)元件,并且TSA使GATA-1蛋白與該位點(diǎn)結(jié)合增強(qiáng)。 6、免疫沉淀結(jié)合Western印跡雜交顯示TSA可直接引起GATA-1蛋白的乙�；�。 7、應(yīng)用螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)證明了GATA-1反應(yīng)元件是WNK4啟動(dòng)子中一個(gè)強(qiáng)大的正調(diào)控元件,同時(shí)它在TSA誘導(dǎo)的WNK4啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活中發(fā)揮重要作用。 結(jié)論 1、WNK4啟動(dòng)子-426～-416區(qū)為GATA-1反應(yīng)元件。 2、TSA引起的GATA-1乙�；稍鰪�(qiáng)其與WNK4基因啟動(dòng)子GATA-1反應(yīng)元件的結(jié)合,從而上調(diào)WNK4啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性,這是乙酰化調(diào)節(jié)WNK4基因表達(dá)的一種機(jī)制。
[Abstract]:Preface
WNK4 (with no lysine[K]kinase-4) gene is a protein kinase gene of newly isolated clones. The gene seventh exon (exon7) and seventeenth exon (EXON17) mutation can lead to autosomal dominant hereditary disease, pseudoaldosterone (Pseudohypoaldosteronism type II, PHA II). The study shows that WNK4 can act on renal distal curvature. The ion transporters (Na-Cl co transporters, NCCT) and ion channels (potassium channels, ROMK) on the tubules and collecting tubes play a role in regulating blood pressure and ion balance. A large number of studies have focused on the exploration of the function of the WNK4 gene, but the upstream regulator of the WNK4 gene is still unclear.
Acetylation plays an important role in the regulation of the expression of a variety of genes. Two types of enzymes, histone acetyltransferase (HAT) and histone deacetylase (HDAC), are involved in the regulation of protein acetylation. Tacopalpsin A (TSA) can specifically inhibit the activity of HDAC and cause the acetylation of histone and some transcriptional related factors. So far, there is no study about the regulation of acetylation on WNK4 gene expression.
In this study, TSA was used as a factor of acetylation to explore the effect of acetylation on the expression level of WNK4 gene rnRNA and protein in human embryonic kidney HEK293 cells, and to identify the effect of GATA-1 reaction elements and TSA on the level of acetylation of GATA-1 protein and the activity of DNA affinity and WNK4 promoter in WNK4 promoter region, so as to explore the WNK4 gene of acetylation. The mechanism of expression.
Materials and methods
First, experimental materials
1, human embryonic kidney HEK293 cell line
2, fetal (22 weeks of gestational age) kidney tissue specimen
3, Real-time PCR and Western blot related reagents
4, molecular cloning and detection of luciferase reporter gene related molecular biological agents.
5, electrophoretic mobility shift assay (EMSA), chromatin immunoprecipitation (ChIP) and immunoprecipitation (IP) related reagents.
Two, experimental method
1, Real-time RT-PCR was used to detect the change of WNK4 mRNA expression level before and after TSA stimulation.
2, Western blot hybridization was used to detect the effect of TSA on the expression level of WNK4 protein.
3, application software and luciferase reporter gene system were used to analyze the structure of WNK4 promoter.
4, RT-PCR assay was used to detect the expression of GATA-1mRNA in HEK293 cells and embryonic kidney tissues.
5, EMSA and ChIP identified the effects of GATA-1 response elements in WNK4 promoter and TSA on the binding capacity of GATA-1 protein to this locus.
6, immunoprecipitation combined with Western blot hybridization was used to detect the effect of TSA on the acetylation level of GATA-1 protein.
7, luciferase reporter gene was used to detect the role of GATA-1 response element in the effect of TSA on WNK4 promoter activity.
Result
1, Real-time RT-PCR results showed that TSA increased the level of WNK4 mRNA expression in a concentration dependent manner.
2, Western blot hybridization showed that TSA induced acetylation significantly increased the level of WNK4 protein in HEK293 cells.
3, software analysis and luciferase reporter gene detection revealed potential binding sites for transcription factors binding to acetylation in the WNK4 promoter.
4, the results of RT-PCR suggest that GATA-1 mRNA has obvious expression in HEK293 cells and embryonic kidney tissues.
5, EMSA and ChIP experiments showed that the WNK4 promoter -426 ~ -416 region was a GATA-1 reaction element in vitro and in vivo, and TSA enhanced the binding of GATA-1 protein to the site.
6, immunoprecipitation combined with Western blot hybridization showed that TSA could directly cause acetylation of GATA-1 protein.
7, the use of the luciferase reporter gene system demonstrated that the GATA-1 reaction element is a powerful positive regulatory element in the WNK4 promoter, and it plays an important role in the transcription activation of the WNK4 promoter induced by TSA.
conclusion
1, the WNK4 promoter -426 to -416 region is the GATA-1 reaction element.
2, TSA induced GATA-1 acetylation can enhance its binding with the WNK4 gene promoter GATA-1 reaction element, thereby up-regulation the WNK4 promoter transcriptional activity, which is a mechanism for acetylation to regulate the expression of WNK4 genes.

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R394

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1880705