本文選題：VSIG4 + 單克隆抗體��； 參考：《蘇州大學(xué)》2009年博士論文

【摘要】： VSIG4,又稱作CRIg,是一種I型跨膜分子,屬于免疫球蛋白超家族成員,含有典型的B7家族的特征。其最先是作為免疫球蛋白超家族的Z39Ig基因被克隆出來(lái),序列一致性的程度和在染色體的定位證實(shí)Z39Ig即為人VSIG4。VSIG4分子和許多免疫球蛋白家族成員一樣有胞外的典型的Ig樣區(qū),人VSIG4存在兩種變異體形式,一種是VSIG4L,編碼區(qū)全長(zhǎng)1200bp,胞外區(qū)編碼IgV和IgC兩個(gè)結(jié)構(gòu)域;另一種為VSIG4S,其編碼區(qū)全長(zhǎng)918bp,胞外區(qū)只編碼IgV結(jié)構(gòu)域,其它區(qū)域則與VSIG4L完全相同,即僅較VSIG4L僅缺少了IgC的編碼區(qū)。人VSIG4L即為Z39Ig。鼠VSIG4分子僅有一種形式,結(jié)構(gòu)和人VSIG4S一樣,均缺乏胞外區(qū)的IgC結(jié)構(gòu)域。人和鼠的VSIG4基因都位于X染色體上hephaestin和moesin基因編碼區(qū)之間q12上。VSIG4的mRNA主要表達(dá)在胎盤(pán)、胎兒組織及成人的肝、肺等組織,其分子主要表達(dá)在由單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞上,而在單核細(xì)胞中幾乎沒(méi)有表達(dá),同時(shí)在炎癥部位的巨噬細(xì)胞,或活化后的巨噬細(xì)胞上VSIG4則呈現(xiàn)表達(dá)下降的趨勢(shì)。在外周血中B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞及粒細(xì)胞均檢測(cè)不到VSIG4的表達(dá)。先前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VSIG4是一種新發(fā)現(xiàn)的巨噬細(xì)胞上的補(bǔ)體受體,可結(jié)合補(bǔ)體C3的降解片段C3b和iC3b,對(duì)于病原體的吞噬其重要作用。而近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)VSIG4還是一種新的B7家族相關(guān)分子,并證實(shí)了VSIG4有抑制T細(xì)胞活化的作用。由于人VSIG4是新認(rèn)識(shí)的分子,且對(duì)于其在T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)方面的相關(guān)研究材料很少,為了對(duì)該分子進(jìn)行深入研究其生物學(xué)效應(yīng)及作用機(jī)制。本研究旨在分別克隆人VSIG4基因兩種不同變異體(VSIG4L和VSIG4S),并建立VSIG4的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株、制備VSIG4-Fc融合蛋白、且以VSIG4的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株作為免疫原免疫小鼠,研制獲取鼠抗人VSIG4單克隆抗體,并以表達(dá)人VSIG4分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞、VSIG4-Fc融合蛋白及抗人VSIG4單抗等為手段,研究揭示人VSIG4分子的生物學(xué)特性及其對(duì)T細(xì)胞共抑制作用的效應(yīng)與方式。 第一部分人VSIG4基因的克隆、基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)功能的初步研究 【目的】克隆人VSIG4基因編碼區(qū)全長(zhǎng)基因,分別構(gòu)建含有人VSIG4基因兩種不同變異體(VSIG4L和VSIG4S)的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,獲得穩(wěn)定表達(dá)VSIG4L和VSIG4S基因的細(xì)胞并初步研究其對(duì)T細(xì)胞的共刺激作用。 【方法】從人正常肺cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出VSIG4L和VSIG4S的全長(zhǎng)基因,并分別克隆入T載體中,雙酶切后裝入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ Term中,與輔助病毒載體用脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T制備含有重組病毒的培養(yǎng)上清,以其培養(yǎng)上清感染L929細(xì)胞72h后,經(jīng)Zeocin篩選出穩(wěn)定表達(dá)VSIG4L或VSIG4S分子的L929細(xì)胞株及293T細(xì)胞株;采用RT-PCR、Western-blot和流式細(xì)胞儀等分析鑒定VSIG4分子的表達(dá);采用MTT和ELISA初步觀察VSIG4基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞增殖及IL-2分泌的影響。 【結(jié)果】成功克隆出VSIG4L和VSIG4S全長(zhǎng)基因,構(gòu)建了含人VSIG4L基因和VSIG4S基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,并獲得含有VSIG4L基因和VSIG4S基因的重組病毒,篩選并鑒定獲得能穩(wěn)定高表達(dá)人VSIG4L和VSIG4S膜型分子的L929及293T的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞;初步檢測(cè)該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞具有體外抑制T細(xì)胞增殖和IL-2分泌的作用。 【結(jié)論】成功建立了可穩(wěn)定高表達(dá)人VSIG4L和VSIG4S膜型分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞,為研制抗人VSIG4單克隆抗體提供了有效的免疫原,也為進(jìn)一步研究VSIG4分子對(duì)T細(xì)胞抑制作用提供了實(shí)驗(yàn)材料。 第二部分人VSIG4-Fc融合蛋白的制備、純化 【目的】獲取穩(wěn)定表達(dá)人VSIG4L-Fc和VSIG4S-Fc融合蛋白基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株并制備純化其融合蛋白 【方法】采用PCR法從pMD19-T-VSIG4L和pMD19-T-VSIG4S中擴(kuò)增出人VSIG4L和VSIG4S基因的胞外段序列,從pMD18-T-hIgG1Fc中擴(kuò)增出人IgG1 Fc恒定區(qū)序列,將VSIG4和Fc順次連接插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-Term,用脂質(zhì)體法與兩個(gè)輔助病毒載體共轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞,用含病毒顆粒的培養(yǎng)上清反復(fù)感染CHO細(xì)胞,以Zeocin篩選,流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定GFP報(bào)告基因表達(dá),獲取能穩(wěn)定分泌人VSIG4-Fc蛋白的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞,并以RT-PCR和Dot-blot分析融合蛋白表達(dá)情況。基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)后,收集的上清經(jīng)超濾濃縮后以Protein G柱純化,再經(jīng)Western blot鑒定其抗原結(jié)合特異性。以流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定融合蛋白和人T細(xì)胞的結(jié)合情況。 【結(jié)果】成功構(gòu)建了pEGZ-Term-VSIG4L-Fc及pEGZ-Term-VSIG4S-Fc重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,并篩選獲得了能穩(wěn)定分泌VSIG4L-Fc及VSIG4S-Fc蛋白的CHO基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株;流式細(xì)胞術(shù)顯示GFP報(bào)告基因得到了較高的穩(wěn)定表達(dá),RT-PCR和Dot-blot分析可分別檢測(cè)出擴(kuò)增的VSIG4 ECD和HuFc特異性片段和所分泌的目的蛋白。Western blot鑒定了純化得到的VSIG4L-Fc及VSIG4S-Fc融合蛋白,且純化后的融合蛋白能夠與T細(xì)胞表面的未知受體結(jié)合。 【結(jié)論】建立了可穩(wěn)定表達(dá)人VSIG4L-Fc和VSIG4S-Fc融合蛋白的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞CHO/VSIG4L-Fc及CHO/VSIG4S-Fc細(xì)胞,并純化得到它們的融合蛋白,為進(jìn)一步研究VSIG4分子對(duì)T細(xì)胞抑制作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第三部分鼠抗人VSIG4單克隆抗體的研制及其生物學(xué)特性的研究 【目的】研制鼠抗人VSIG4單克隆抗體,為探討人VSIG4分子的表達(dá)特性及其介導(dǎo)的負(fù)性信號(hào)對(duì)人T淋巴細(xì)胞抑制作用的效應(yīng)與方式提供必備的物質(zhì)手段。 【方法】以高表達(dá)人VSIG4L分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L929/VSIG4L為免疫原,常規(guī)免疫BALB/c小鼠,利用B淋巴雜交瘤技術(shù),將免疫小鼠脾臟細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0融合,以VSIG4L和VSIG4S的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞為抗原篩選陽(yáng)性細(xì)胞;經(jīng)間接免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)分析、反復(fù)篩選和多次克隆化培養(yǎng),獲得特異分泌鼠抗人VSIG4分子單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株;采用細(xì)胞核染色體計(jì)數(shù)、Ig亞型快速定性試紙法、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抑制以及Western blot等試驗(yàn),對(duì)獲得的雜交瘤細(xì)胞株及單克隆抗體進(jìn)行生物學(xué)特性的鑒定;用間接免疫熒光法初步分析單抗對(duì)不同來(lái)源人腫瘤細(xì)胞株及巨噬細(xì)胞的結(jié)合反應(yīng)。 【結(jié)果】成功獲得3株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人VSIG4單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為2H4、9A7和9D5。經(jīng)過(guò)快速定性試紙分析顯示,3株單抗輕鏈均為κ鏈,重鏈均為IgG1亞類;間接免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)分析單抗2H4和9A7均可以和VSIG4L和VSIG4S結(jié)合,9D5僅能和VSIG4L結(jié)合,Western blot顯示9A7均可以和VSIG4L和VSIG4S結(jié)合,9D5僅能和VSIG4L結(jié)合,2H4均未見(jiàn)特異性陽(yáng)性條帶。競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)顯示3株抗體間均不產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)作用。對(duì)mAb生物學(xué)特性的研究結(jié)果表明,3株mAb均能識(shí)別巨噬細(xì)胞以及Jurkat、THP-1、H446等腫瘤細(xì)胞株表面的VSIG4分子。 【結(jié)論】成功獲得3株穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人VSIG4單抗的雜交瘤細(xì)胞株,且它們識(shí)別不同的抗原表位,為揭示VSIG4分子的表達(dá)特性、深入探討VSIG4對(duì)T細(xì)胞抑制的調(diào)節(jié)作用及信號(hào)機(jī)制提供了必要的物質(zhì)手段。 第四部分人VSIG4分子對(duì)T細(xì)胞的共刺激效應(yīng)的研究 【目的】利用研制獲得的人VSIG4基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞、融合蛋白及抗人VSIG4單克隆抗體等為手段,探討人VSIG4分子對(duì)T淋巴細(xì)胞共抑制作用的方式與效應(yīng)。 【方法】免疫磁珠分離純化T細(xì)胞及CD4+、CD8+ T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞,以抗CD3激發(fā)型單抗刺激,聯(lián)合或不聯(lián)合抗人CD28單抗,從而模擬提供T細(xì)胞活化信號(hào),同時(shí)采用表達(dá)膜型VSIG4L和VSIG4S分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞、VSIG4L-Fc和VSIG4S-Fc融合蛋白及鼠抗人VSIG4單克隆抗體等,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、MTT法和ELISA等方法分別測(cè)定或分析它們對(duì)T淋巴細(xì)胞活化、增殖及IL-2產(chǎn)生的抑制作用。 【結(jié)果】 1.以VSIG4L-Fc和VSIG4S-Fc為干預(yù)因素,它們對(duì)T細(xì)胞的增殖均較對(duì)照組有抑制作用(P0.05),且與PD-L1-Fc抑制T細(xì)胞增殖效果相仿(P0.05);在不同活化信號(hào)刺激下,VSIG4L-Fc和VSIG4S-Fc也均能抑制T細(xì)胞的增殖。且VSIG4L-Fc和VSIG4S-Fc間均沒(méi)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 2.以表達(dá)膜型VSIG4L和VSIG4S分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞為干預(yù)因素,它們對(duì)CD4+、CD8+ T細(xì)胞及總T細(xì)胞的增殖均較對(duì)照組有明顯抑制作用;對(duì)CD4+ T細(xì)胞IL-2的分泌也均有明顯抑制作用;VSIG4L和VSIG4S的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞間沒(méi)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3.以抗CD3單抗激發(fā)T細(xì)胞增殖,以VSIG4基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行抑制,加入單抗2H4、9A7和9D5觀察它們對(duì)其的阻斷效應(yīng),MTT檢測(cè)結(jié)果顯示,單抗9A7能一定程度地阻斷VSIG4L和VSIG4S介導(dǎo)的對(duì)T細(xì)胞的抑制作用,但2H4和9D5的阻斷效應(yīng)與IgG對(duì)照組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 4.用抗CD3單抗刺激T細(xì)胞增殖,VSIG4L-Fc阻斷T細(xì)胞增殖,在加入不同濃度的外源人IL-2后,發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng),VSIG4L-Fc對(duì)T細(xì)胞的抑制作用近乎消失,并且在不同濃度的VSIG4L-Fc抑制時(shí),其效果亦是如此。 【結(jié)論】VSIG4分子可以明顯抑制T細(xì)胞增殖和IL-2的分泌,且其VSIG4L和VSIG4S對(duì)T細(xì)胞抑制效應(yīng)相仿,單抗9A7可以一定程度阻斷此效應(yīng),并且這種抑制效應(yīng)可以被外源的IL-2消除。
[Abstract]:VSIG4 ( VSIG4 ) is a novel molecule of B7 family .


Cloning of the first partial human VSIG4 gene , establishment of a gene - transfected cell line and preliminary study of its biological function


Objective To construct a recombinant retroviral vector containing two variants of VSIG4 ( VSIG4L and VSIG4S ) in human VSIG4 gene coding region , and to obtain the cells stably expressing VSIG4L and VSIG4S genes and to investigate their co - stimulatory effect on T cells .


銆愭柟娉曘，

本文編號(hào)：1806606