本文選題：羊膜 + 間充質(zhì)干細(xì)胞�。� 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2008年博士論文

【摘要】：目的： 1.分離、培養(yǎng)和鑒定人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞,觀察其生物學(xué)特性,探討其應(yīng)用于神經(jīng)再生治療的可行性。 2.通過體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn),探討人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化的可能性。 3.對人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)前后鈉離子通道的電生理特性進(jìn)行研究,探討其在向視網(wǎng)膜神經(jīng)元樣細(xì)胞分化過程中細(xì)胞功能的變化情況。 方法： 1.經(jīng)產(chǎn)婦知情同意,無菌采集健康足月剖腹產(chǎn)胎盤6份。采用機(jī)械法將羊膜從胎盤組織上剝離,PBS沖洗后剪成碎片,加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液37℃消化10mmin,共4次,收集細(xì)胞,用DMEM/F12/10%FBS/10ng/mL EGF培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)和純化。 2.倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；記錄生長曲線；用流式細(xì)胞儀鑒定傳1-3代人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志CD45、CD90(Thy1)和CD49d；免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法和流式細(xì)胞儀檢測神經(jīng)干／祖細(xì)胞標(biāo)記蛋白Nestin、Vimentin和Musash-1的表達(dá)。 3.用2%DMSO/200μmol/L BHA/10ng/mL bFGF誘導(dǎo)第3代人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞,用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法和流式細(xì)胞儀檢測誘導(dǎo)前后神經(jīng)譜系標(biāo)記蛋白Nestin、MAP2、NSE、GFAP和光感受器細(xì)胞標(biāo)記蛋白Rhodopsin的表達(dá)；實(shí)時熒光定量PCR檢測誘導(dǎo)0、3和7天Nestin、Rhodopsin和SCN2A mRNA的表達(dá)；通過全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄誘導(dǎo)前后細(xì)胞表面鈉離子電流。 結(jié)果： 1.人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞為貼壁細(xì)胞,表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞樣,可在體外大量擴(kuò)增并純化；表型分析結(jié)果顯示：CD90(Thyl)、CD49d陽性表達(dá),CD45陰性表達(dá)；人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)干／祖細(xì)胞的標(biāo)記蛋白,流式細(xì)胞儀顯示從傳1代至4代,Nestin陽性和Vimentin陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均在80-90%,而Musashi-1陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)則維持在95%以上。 2.誘導(dǎo)分化后,大部分細(xì)胞變成具有細(xì)長突起的神經(jīng)元樣形態(tài)；流式細(xì)胞儀檢測顯示：誘導(dǎo)7d后Nestin陽性細(xì)胞從81.3%下降至24.9%,而MAP2陽性細(xì)胞從15.7%上升至91.3%,Rhodopsin陽性細(xì)胞從10.3%上升至97.1%,NSE陽性細(xì)胞從20.9%上升至94.3%,GFAP陽性細(xì)胞從1.4%上升至18.0%,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析有顯著性差異(P0.05)；實(shí)時熒光定量PCR檢測顯示：誘導(dǎo)3天后,Nestin的mRNA迅速下降為原來的0.19倍,7天后下降為0.15倍；誘導(dǎo)3天后,Rhodopsin的mRNA上升為原來的1.62倍,7天后上升為2.06倍；誘導(dǎo)3天后,SCN2A的mRNA上升為原來的1.24倍,7天后上升為1.83倍；人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在誘導(dǎo)前未記錄到瞬時鈉內(nèi)向電流(0/13),誘導(dǎo)后部分細(xì)胞受去極化刺激時記錄到鈉離子內(nèi)向電流(4/12),細(xì)胞表面鈉離子電流出現(xiàn)率的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.039)。 結(jié)論： 1.人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞可成功在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化,生物學(xué)性狀穩(wěn)定,含有豐富的神經(jīng)前體細(xì)胞,可以作為一種優(yōu)良的神經(jīng)再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中組織工程、細(xì)胞治療和基因治療的種子細(xì)胞來源。 2.人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞能夠在體外誘導(dǎo)分化為表達(dá)視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的標(biāo)記蛋白、具有可興奮性的神經(jīng)元樣細(xì)胞。
[Abstract]:Objective:
1. isolation, culture and identification of human amniotic mesenchymal stem cells, observe its biological characteristics, and explore its feasibility in the treatment of nerve regeneration.
2. to explore the possibility of human amniotic mesenchymal stem cells differentiating into retinal cells through in vitro induced differentiation experiments.
3. the electrophysiological characteristics of the sodium channel of amniotic mesenchymal stem cells were studied before and after induction in vitro, and the changes of cell function during the differentiation of the retinal neuron like cells were investigated.
Method錛，

本文編號：1784870