本文選題：結(jié)核分枝桿菌 + 恥垢分枝桿菌��； 參考：《大連醫(yī)科大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】： 結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的最嚴(yán)重的疾病之一,自20世紀(jì)80年代起,已經(jīng)受到控制的結(jié)核病疫情再次抬頭。結(jié)核病的致病菌是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, Tb),該細菌具有特殊細胞壁結(jié)構(gòu),對其生存和繁殖極為重要。其核心結(jié)構(gòu)由肽聚糖、聚阿拉伯半乳糖和分枝菌酸組成。其中聚阿拉伯半乳糖與肽聚糖之間靠L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺雙糖銜接分子連接。銜接雙糖是結(jié)核分枝桿菌細胞壁極其重要的結(jié)構(gòu),破壞這一結(jié)構(gòu),細胞壁的完整性將遭到破壞從而結(jié)核分枝桿菌不能生存。 L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺雙糖銜接分子的合成第一步驟是在一個N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶的催化作用下,將GlcNAc-1-P (N-乙酰葡糖胺-1-磷酸)基團轉(zhuǎn)移到C50-P (Decaprenyl phosphate)上形成C50-P-P-GlcNAc。顯而易見,在以上的酶促反應(yīng)中,這個N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶起到了非常關(guān)鍵的銜接作用,如果該酶被破壞掉,雙糖銜接分子將不能合成。 在大腸桿菌(E. coli)中,WecA酶的功能是作為N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶而參與脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)的重要組成成分O-抗原多糖(O-antigenic polysaccharide, O-PS)的合成。BLAST分析表明,E. coli的WecA氨基酸序列與M. tuberculosis WecA氨基酸序列有27%的相似性,提示M. tuberculosis的WecA很可能也具有N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶的活性,可以將GlcNAc-P基團轉(zhuǎn)移到C50-P上,再接受鼠李糖基完成雙糖銜接分子的合成。 本文實驗的目的是：(1)通過在wecA基因缺陷菌株E. coli MV501導(dǎo)入結(jié)核分枝桿菌Rv1302以及恥垢分枝桿菌MSMEG_4947基因,驗證兩個基因編碼酶的功能以及利用高效液相和質(zhì)譜進行酶功能的鑒定。(2)確定wecA基因為結(jié)核桿菌生長必需基因。用同源重組方法建立mc。155wecA基因敲除菌株。通過測定wecA基因敲除菌株的生長曲線,研究wecA基因與分枝桿菌生長的關(guān)系。利用溫度轉(zhuǎn)換實驗,造成mc2155wecA基因敲除菌株缺乏WecA,通過比對掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)結(jié)果來研究WecA缺乏對該突變株細菌的形態(tài)學(xué)以及結(jié)構(gòu)的影響。在含有營救質(zhì)粒的mc2155 wecA基因敲除菌液中加入不同濃度的衣霉素,通過繪制細菌生長曲線來觀察衣霉素對WecA酶功能的抑制作用。(3)WecA酶在不同大腸桿菌宿主中的表達以及酶活性檢測。利用表達載體pET16b攜帶Tb wecA分別轉(zhuǎn)化到不同的大腸桿菌BL21(DE3),C41(DE3)以及ER2566中。表達WecA蛋白并提取上述各轉(zhuǎn)化菌的膜蛋白,進行點雜交以及Western blot分析,并在適合條件下與底物一起進行酶促反應(yīng),通過高效液相色譜來檢測底物UDP-GlcNAc濃度的變化,從而判斷WecA是否在不同大腸桿菌宿主中得到表達。 本文獲得以下結(jié)果： 1.對wecA基因缺陷菌株E.coli MV501中LPS合成缺陷的補償以及WecA酶功能的鑒定 將pMD18-Sm wecA質(zhì)粒(pYJ-1)和pMD18-Tb wecA質(zhì)粒(pYJ-2)電轉(zhuǎn)化到wecA基因缺陷菌株E.coli MV501中,提取LPS并且進行電泳。以未轉(zhuǎn)化任何質(zhì)粒的MV501以及轉(zhuǎn)化了pUC 18質(zhì)粒的MV501作為陰性對照。根據(jù)電泳結(jié)果,可以看到在轉(zhuǎn)化了pYJ-1和pYJ-2的MV501中出現(xiàn)了清晰的LPS條帶,而陰性對照細菌中提取的LPS則沒有相應(yīng)的條帶。 提取上述三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的E.coli MV501細菌的膜蛋白。將膜蛋白與底物C50-P以及UDP.GlcNAc一起進行孵育,反應(yīng)上清中UDP.GlcNAc含量的變化通過高效液相以及高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀來檢測。檢測的結(jié)果表明,轉(zhuǎn)化了pYJ-1質(zhì)粒和pYJ-2質(zhì)粒的細胞膜蛋白反應(yīng)體系中,底物UDP.GlcNAc的含量與陰性對照相比有所減少。 2.wecA基因是結(jié)核桿菌生長必需基因以及衣霉素對WecA蛋白的抑制作用 (1)wecA基因缺陷菌株mc2155 YJ-2的構(gòu)建 酶切pUC4K質(zhì)粒獲得Kan抗性基因(KanR)并克隆到pYJ-1質(zhì)粒中,產(chǎn)生Sm wecA::KanR突變基因。再將突變基因克隆到pPR27-xylE質(zhì)粒,構(gòu)建出條件性復(fù)制質(zhì)粒pPR27-xylE-Sm wecA::KanR(pYJ-4). 酶切質(zhì)粒pYJ-2,獲得Tb wecA基因,克隆到pET23b-Phsp60質(zhì)粒的相應(yīng)位點,構(gòu)建出pET23b-Phsp60-Tb wecA(pYJ-5)質(zhì)粒。酶切pYJ-5,將酶切后的片斷Phsp60-Tb wecA克隆到pCG76質(zhì)粒,構(gòu)建出pCG76-Tb wecA營救質(zhì)粒(pYJ-6)。 將pYJ-4電轉(zhuǎn)化到mc2155感受態(tài)細菌中,42℃條件下SmwecA::KanR與mc2 155基因組中的Sm wecA發(fā)生同源重組。Southern雜交分析顯示發(fā)生第一次同源重組的mc2155 YJ-1突變菌株有兩種同源重組方式,#2,7,8菌株以第一種方式發(fā)生同源重組,#3,4,13,1 6菌株以第二種方式發(fā)生同源重組。 將pYJ-6營救質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到mc2155 YJ-1感受態(tài)細菌中,用含10%蔗糖的選擇性LB瓊脂培養(yǎng)基,這種選擇壓力下,mc2155 YJ-1基因組中的Sm wecA::KanR與Sm wecA發(fā)生第二次同源重組。用Southern印跡方法篩選出mc2155 YJ-2突變菌株,即Sm wecA基因敲除菌株。 (2)mc2155 YJ-2生長曲線的測定 測定mc2155 YJ-2突變菌株在30℃和42℃的生長曲線,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該突變菌株在30℃可以生長,但在42℃不生長,說明wecA基因是分枝桿菌生長必需基因。 在隨后的溫度轉(zhuǎn)換實驗中,讓mc2155 YJ-2突變菌株在營救質(zhì)�？梢詮�(fù)制、表達的30℃生長20小時,使之表達一定量Tb WecA蛋白后,提高溫度至42℃,使pYJ-6不能復(fù)制,影響Tb WecA蛋白的表達。在Tb WecA逐漸缺乏的情況下,測定mc2155 YJ-2突變菌株的生長曲線。結(jié)果顯示mc2155 YJ-2突變菌株可以在420C繼續(xù)增殖1-2天,第三天以后細菌的生長受到抑制,菌量開始減少,這進一步說明wecA基因是分枝桿菌生長必需基因。 (3) WecA缺乏對突變菌株mc2155 YJ-2細菌形態(tài)的影響 在溫度轉(zhuǎn)換實驗中,取mc2155 YJ-2突變菌株細菌用掃描電鏡觀察其細菌形態(tài)。結(jié)果顯示在30℃條件下,該mc2155 YJ-2突變菌株均呈短棒狀、輪廓飽滿、表面光滑的形態(tài)。與野生型對照無明顯差異。但在42℃條件下,營救質(zhì)粒Tb wecA表達受影響致使WecA蛋白缺乏時,一些細菌表面出現(xiàn)明顯易見的皺褶、凹陷,細菌之間有相互粘連以及融合,許多細菌的一端開始出現(xiàn)腫脹。生長144小時的細菌輪廓極不規(guī)則,細菌腫脹更加厲害,很多細菌表面有大量破損。 透射電鏡結(jié)果顯示,30℃培養(yǎng)生長72小時以及144小時的細菌結(jié)構(gòu)正常,可見完整的細胞外膜,細菌形狀規(guī)則。在42℃培養(yǎng)72小時后,細胞外膜出現(xiàn)皺褶,細胞膜有脫落。在42℃培養(yǎng)144小時后,細菌形狀明顯不規(guī)則,有脹大的頭部和細長的尾部出現(xiàn),細菌內(nèi)部溶解并有大量空泡,部分細菌中部出現(xiàn)橫隔。 掃描電鏡以及透射電鏡結(jié)果說明WecA蛋白質(zhì)的缺乏影響細胞壁的合成,使細菌形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,最終導(dǎo)致細菌死亡。 (4)衣霉素對Tb WecA酶功能的抑制 含有營救質(zhì)粒的mc2155 YJ-2基因敲除菌株在30℃進行培養(yǎng)24小時,在菌液中加入不同濃度的衣霉素繼續(xù)培養(yǎng),每隔24小時進行一次菌液吸光度的測定,培養(yǎng)120小時之后繪制細菌生長曲線,根據(jù)細菌生長情況判斷衣霉素對WecA蛋白功能的影響。生長曲線表明加入衣霉素的細菌生長受到一定程度的抑制,其抑制程度與衣霉素的濃度呈正相關(guān)。 3. Tb WecA酶在不同宿主大腸桿菌中的表達以及酶活性測定 將Tb wecA基因與pET16b載體相連后,質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到不同的大腸桿菌宿主BL21 (DE3), C41 (DE3)以及ER2566菌株中,提取膜蛋白進行SDS-PAGE以及Western blot檢測,未見到有明顯雜交條帶出現(xiàn),但是點雜交結(jié)果顯示為陽性。將上述所有膜蛋白與底物C50-P以及UDP-GlcNAc一起進行孵育,上清中UDP-GlcNAc的含量通過高效液相色譜來檢測。檢測結(jié)果表明,反應(yīng)體系中的底物UDP-GlcNAc與對照相比都有不同程度的減少。 結(jié)論： 1.在E. coli wecA基因缺陷菌株MV501中導(dǎo)入攜帶Sm wecA和TbwecA的質(zhì)粒,質(zhì)�？梢员磉_并補償E. coli MV501 WecA蛋白缺陷,補償性合成LPS。初步判斷在分枝桿菌中WecA具有N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶功能。 2.運用HPLC方法以及LC/MS/MS方法分別檢測了在E. coli wecA基因缺陷菌株MV501中表達的Sm WecA和Tb WecA酶活性,并對其酶促反應(yīng)條件進行了優(yōu)化。證明了Sm wecA和Tb wecA基因編碼的WecA蛋白具有N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶功能。 3.以恥垢分枝桿菌mc2155菌株為實驗?zāi)Ｐ?構(gòu)建了mc2155 wecA敲除突變菌株mc2155 YJ-2。通過研究mc2155 YJ-2在30℃和42℃生長情況,確定Tb wecA基因為分枝桿菌生長必需基因。 4.通過對mc2155 YJ-2在溫度轉(zhuǎn)換(從30℃到42℃)實驗中生長的研究,進一步證實了wecA基因為結(jié)核分枝桿菌生長必需基因。 5.通過掃描電鏡和透射電鏡觀察了mc2155 YJ-2在溫度轉(zhuǎn)換實驗中細菌形態(tài)及結(jié)構(gòu)的變化,證明了WecA缺乏會引起一系列細菌形態(tài)變化及結(jié)構(gòu)的改變,最終可能引起細菌死亡。 6.在mc2155 YJ-2細菌中分別加入不同濃度衣霉素進行生長曲線的測定,結(jié)果表明衣霉素抑制Tb WecA酶的活性,并且其作用具有濃度依賴性。 7.本研究所獲得wecA基因敲除菌株mc2155 YJ-2可作為篩選WecA抑制劑的細菌模型來篩選先導(dǎo)化合物,以便發(fā)現(xiàn)特異性高且對人體無毒副作用的抗結(jié)核新藥。 8.初步嘗試在不同大腸桿菌中表達膜蛋白WecA,并運用點雜交方法加以印證。通過HPLC檢測酶促反應(yīng)中底物的減少,再次印證Tb WecA具有N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶功能。 本研究結(jié)果確定了Tb wecA作為結(jié)核桿菌生長必需基因決定著細菌的存亡,并驗證了Tb WecA的酶功能,分別用不同方法證實了WecA是N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶,參與細胞壁重要結(jié)構(gòu)雙糖銜接分子的合成,其酶活性可以被衣霉素所抑制。 未來研究方向： 1.選擇合適的載體以及表達菌株,優(yōu)化WecA的表達條件,實現(xiàn)膜蛋白WecA的高表達以及純化。 2.在底物存在條件下體外模擬WecA酶促反應(yīng)過程,用放射自顯影或者TLC方法進一步確定WecA酶活性。 3.研究wecA基因敲除菌株的蛋白質(zhì)組學(xué)。從在42℃生長的wecA基因敲除細菌中提取胞漿蛋白進行雙向電泳,重復(fù)和優(yōu)化雙向電泳條件,并根據(jù)雙向電泳結(jié)果,對感興趣的蛋白質(zhì)差異點用胰蛋白酶進行酶解,然后用質(zhì)譜方法獲得肽質(zhì)譜并與數(shù)據(jù)庫比對,以發(fā)現(xiàn)更多的靶點。然后進一步采用分子生物學(xué)的方法,克隆這些差異蛋白的基因,鑒定其功能,以期發(fā)現(xiàn)wecA基因與其它基因之間是否存在相互調(diào)控相互影響的關(guān)系。 4.分別提取30℃和42℃生長的wecA基因敲除細菌的細胞壁,用HPLC分析兩者的細胞壁糖組分變化。 5.用TLC方法進一步篩選對WecA酶有抑制活性的先導(dǎo)化合物,以期尋找到新型抗結(jié)核藥物。在此基礎(chǔ)上,用本文構(gòu)建的wecA基因敲除細菌模型進一步鑒定該化合物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R378

【共引文獻】

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本文編號：1784465