本文選題：腸缺血再灌注缺 + 缺血再灌注損傷��； 參考：《昆明醫(yī)學院》2010年博士論文

【摘要】： 前言 缺血再灌注(ischemia/reperfusion;Ⅰ/R)損傷是組織器官在缺血的基礎上恢復血流后損傷反而加重的現(xiàn)象,是內、外科常見的一種損傷。腸道對缺血最敏感的組織器官之一,腸缺血再灌注常見于嚴重創(chuàng)(燒)傷、休克、感染、腸移植、新生兒缺血壞死性腸炎及危重病患者,腸缺血再灌注(intestinalischemia/reperfusion;Ⅱ/R)常常原發(fā)或繼發(fā)性腸道疾病,是臨床眾多疾病的病理生理基礎,是引發(fā)膿毒癥及多器官功能衰竭的始動因素之一。缺血再灌注腸損傷后腸黏膜屏障功能受損,通透性增加,促使腸道細菌及內毒素移位、大量氧自由基生成、炎性細胞浸潤增加,細胞因子和炎癥介質的失控性釋放,不僅引起腸道局部損傷,而且造成遠隔器官損害,尤其是肺損傷,誘發(fā)全身炎癥反應綜合癥及多器官功能衰竭,病情兇險、嚴重,在臨床上具有極高的發(fā)病率和病死率。由于腸缺血再灌注腸損傷在各類臨床疾病中均可能原發(fā)或繼發(fā)性發(fā)生,對于其發(fā)病機制的探討一直是學者們的研究熱點。 絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinases;MAPKs)是真核細胞內一組高度保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶,目前已知MAPKs有c-Jun氨基末端激酶(JNK)、細胞外信號蛋白激酶(ERK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)三種主要形式。在損傷應激、氧自由基、感染和炎癥等刺激條件下,細胞內MAPKs蛋白的蘇氨酸/酪氨酸雙位點磷酸化反應從而被順序激活,通過細胞內信號傳遞級聯(lián)效應使基因表達發(fā)生變化,在調節(jié)組織炎癥反應、細胞增殖與凋亡和免疫反應等病理生理過程發(fā)揮重要作用。由于各種MAPK本身和其作用底物各有特點,MAPKs三個主要成員成具有相對獨立而又相互聯(lián)系的信號傳遞網絡,三種形式的MAPKs執(zhí)行不同的生理功能。有研究表明,MAPKs參與了缺血再灌注腸損傷的發(fā)病過程,但是,在腸缺血再灌注早期,有關MAPKs蛋白表達及活化過程尚不清楚,MAPKs蛋白及其下游信號通路參與腸缺血再灌注損傷的機制尚未闡明。采用夾閉腸系膜上動脈方法造成小鼠腸缺血再灌注損傷,本實驗第一部分觀察損傷后腸組織MAPKs及其下游信號通路的變化,探討小腸組織MAPKs活化及其介導凋亡信號通路在小鼠小腸缺血再灌注損傷中的可能作用。 肺臟不僅是氣體交換的器官,也是一些細胞因子和激素生與滅活的場所,經過各種途徑入血的毒素、內源性炎性介質等物質經靜脈回流后都要進入肺循環(huán),加上肺臟本身在解剖結構上相對較脆弱,肺循環(huán)具有面積大、流速慢、壓力低的特點,使肺臟實質細胞暴露在毒性物質的機會和時間增加,因此,在諸多臟器中,肺臟最易受到各種致病因素的打擊,也是機體失控炎性損害的主要靶器官之一。盡管目前對腸缺血再灌注肺損傷進行大量的研究,但是其分子機理尚未完全闡明。腸缺血再灌注導致腸粘膜損,腸屏障功能破壞,引起細菌/內毒素移位,氧自由基、細胞因子及炎性介質等有害物質釋放并進入全身循環(huán),導致遠隔器官損害;同時,它們又都是刺激MAPKs信號通路活化的有力因素。我們由此推測,腸缺血再灌注可能通過激活肺組織MAPKs信號通路活化,參與腸缺血再灌注肺損傷的發(fā)生。肺損傷特征性主要表現(xiàn)為肺部劇烈炎癥反應,炎癥細胞浸潤和炎性細胞因子合成、釋放增加,其中細胞因子TNF-α、IL-1β在肺組織炎癥反應中起著關鍵作用。第二部分通過觀察p38 MAPK信號通路活化在腸缺血再灌注肺損傷的活化過程,使用特異性p38 MAPK抑制劑SB239063抑制p38 MAPK蛋白活性,探討其在小腸缺血再灌注肺損傷中的作用及可能機制。 第一部分MAPKs蛋白活化在小腸缺血再灌注損傷的作用 目的:觀察小腸缺血再灌注后小腸組織MAPKs蛋白活化過程及凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax和活化型Caspase-3的變化,探討MAPKs活化及其介導凋亡信號通路在小腸缺血再灌注損傷中的可能作用。 方法:采用夾閉腸系膜上動脈(superior mesenteric artery;SMA)后再灌注造成小腸缺血再灌注損傷小鼠動物模型,經腹腔注射1%戊巴比妥鈉50mg.kg~(-1)麻醉。(1)8-10周齡的雄性C57 BL/6小鼠隨機分為腸缺血30min、40min、50min和60min,每組8只,觀察14d內腸缺血再灌注后小鼠生存率。(2)小鼠隨機分為假手術組(sham),腸缺血再灌注處理組(Ⅱ/R):分再灌注即刻(0)、0.5h、1h、4h、6h和12h不同再灌注時間組。夾閉SMA 40min再灌注造成小鼠Ⅱ/R模型,假手術組同樣進行開腹手術但不夾閉動脈。假手術后及腸缺血再灌注后不同時間相處死小鼠取小腸標本,回腸組織10%中性福爾馬林液固定待病理檢查,用Chiu雙盲病理評分,評價腸損傷情況程度;原位末端標記(TUNEL)法對腸組織凋亡細胞進行定位檢測;全細胞裂解法提取小腸總蛋白,Western blot蛋白免疫印跡法檢測小腸組織JNK、ERK和p38 MAPK蛋白,磷酸化JNK、ERK和p38 MAPK蛋白,以及與凋亡相關蛋白Cleaved-caspase-3、Bcl-2和Bax表達水平,以磷酸化MAPKs蛋白代表其活化水平。 結果:(1)腸缺血30 min小鼠生存率100%,隨著腸缺血時間的增加,動物生存率逐漸降低,腸缺血60 min動物生存率僅約30%。(2)腸組織大體表現(xiàn)及病理評分結果均顯示,腸缺血40 min后再灌注早期腸損傷嚴重,尤以再灌注1h腸組織病理損傷最重,至12h腸組織結構基本恢復正常;TUNEL法定位凋亡細胞結果表明,凋亡細胞分布廣泛,包括黏膜、黏膜固有層,黏膜下層,甚至肌層均存在凋亡細胞,涉及細胞成分多樣,以腸上皮細胞凋亡為主。腸缺血再灌注損傷細胞凋亡與壞死并存。(3)腸缺血再灌注早期促凋亡的活化型caspase-3蛋白表達增加,與假手術組比較,再灌注0.5h、1h小腸組織活化型caspase-3明顯增加(P＜0.01),與小腸組織病理損害時相過程基本一致,同時抗凋亡Bcl-2蛋白明顯下調(P＜0.01);各組間促凋亡蛋白Bax表達無統(tǒng)計學差異。(4)腸缺血再灌注不影響腸組織JNK、ERK、p38 MAPK蛋白表達,而磷酸化JNK、ERK、p38 MAPK蛋白表達明顯增加。與假手術對照組比較,腸缺血及再灌注早期,小腸組織JNK持續(xù)活化,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);腸缺血再灌注導致磷酸化ERK顯著增加,至再灌注4h下降至接近正常,然后ERK活化再次明顯增加(P＜0.01),ERK活化呈現(xiàn)明顯上升-下降-再上升動態(tài)活化過程;腸缺血p38 MAPK活化明顯減少(P＜0.05),再灌注0.5 h腸組織磷酸化p38 MAPK急劇上升(P＜0.01),其后p38 MAPK持續(xù)活化,盡管與假手術對照組差異無顯著性。 結論:腸缺血再灌注損傷細胞凋亡與壞死并存;腸缺血再灌注早期小腸組織JNK、p38 MAPK活化、可能通過下調抗凋亡蛋白Bcl-2表達,參與了Caspase-3依賴的細胞凋亡和組織損害,ERK的活化與受損腸組織及時修復有關。對進一步研究MAPKs信號通路活化在Ⅱ/R腸損傷中的作用具有指導意義。 第二部分p38 MAPK活化在腸缺血再灌注肺損傷的作用 目的:觀察小腸缺血再灌注后肺組織p38 MAPK活化規(guī)律、以及腸和肺組織炎性細胞因子TNF-α、IL-1β基因轉錄水平的變化,探討p38 MAPK蛋白活化在小鼠小腸缺血再灌注腸道本身及肺損傷中的作用及可能機制。 方法:為探討腸缺血再灌注后肺組織p38 MAPK活化動態(tài)過程,10周齡健康雄性C57 BL/6小鼠隨機分為假手術組(sham),腸缺血再灌注組(Ⅱ/R):再分為腸缺血45min再灌注即刻(0)、0.5h、4h和6h。為了進一步觀察p38 MAPK活化在場缺血再灌注肺損傷的可能作用,動物隨機分為假手術組(sham)、缺血再灌注對照組(Ⅰ/R)和缺血再灌注+SB239063處理組(Ⅰ/R+SB239063組),Ⅰ/R+SB239063組于術前1h腹腔注入p38 MAPK抑制劑SB239063(3 mg.kg~(-1)),另兩組注入等量生理鹽水。采用夾閉C57BL/6小鼠腸系膜上動脈45 min后再灌注6h的造成腸缺血再灌注損傷模型。于再灌注6h麻醉后處死小鼠,取小腸、肺標本,Western blot蛋白質印跡法檢測肺組織磷酸化p38 MAPK蛋白水平;RT-PCR法檢測小腸、肺組織TNF-α、IL-1βmRNA表達;HE染色,光學顯微鏡觀察回腸及肺組織病理學改變,分別用Chiu方法腸損傷、Gloor方法肺損傷病理評分,評價回腸及肺損傷嚴重程度。 結果:(1)腸缺血后再灌注導致肺組織p38 MAPK蛋白快速、持續(xù)活化,與假手術組比較,差異有顯著性(P＜0.01)。(2)腸缺血再灌注引起腸道局部及肺損傷,小腸、肺組織TNF-α、IL-1β基因表達水平顯著升高。(3)在腸缺血后再灌注6h,SB239063抑制肺組織p38MAPK活化,下調肺組織TNF-α、IL-1βmRNA表達水平,減輕腸缺血再灌注肺損傷(P＜0.05);SB239063顯著下調小腸組織IL-1β基因表達,盡管不影響TNF-αmRNA表達水平,減輕腸缺血再灌注腸損傷。 結論:p38 MAPK活化在小腸缺血再灌注肺損傷中起重要作用,抑制p38MAPK降低小腸及肺部分促炎性細胞因子基因轉錄水平,減輕腸缺血再灌注引起的腸道本身及肺損傷,抑制p38 MAPK活化可以作為預防腸缺血再灌注肺損傷的治療靶點。
[Abstract]:Foreword



Intestinal ischemia / reperfusion ( I / R ) injury is one of the most sensitive tissues and organs .



MAPKs is a highly conserved serine / threonine protein kinase in eukaryotic cells . It is known that MAPKs plays an important role in the pathogenesis of ischemia - reperfusion injury .



The lung injury is the most vulnerable to various pathogenic factors , such as acute lung inflammation reaction , inflammatory cell infiltration and inflammatory cytokines .



Role of the first part of MAPKs protein activation in ischemia / reperfusion injury of small intestine



Objective : To observe the activation of MAPKs protein and the changes of Bcl - 2 , Bax and activated Caspase - 3 in small intestine after ischemia / reperfusion in small intestine .



Methods : The rats were randomly divided into sham operation group ( sham operation group ) and intestinal ischemia / reperfusion group ( 鈪，

本文編號：1753743