本文選題：表皮葡萄球菌 + 生物膜��； 參考：《復(fù)旦大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】：凝固酶陰性的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)為人體皮膚表面常見的共生菌,通常不致病。但近年來隨著各種植入性醫(yī)療材料的廣泛使用,表皮葡萄球菌已成為院內(nèi)感染的主要條件致病菌,主要原因是其能在這些醫(yī)療材料表面形成生物膜(biofilm,BF)樣結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)能夠更好地保護(hù)細(xì)菌抵抗抗生素的治療和人體免疫系統(tǒng)的攻擊并從中不斷釋放細(xì)菌,從而造成機(jī)體的反復(fù)感染,最終不得不將被污染的植入性醫(yī)療材料通過外科手術(shù)摘除,對(duì)患者造成極大的痛苦和巨大的經(jīng)濟(jì)損失。此外,由于抗生素的大量使用導(dǎo)致表皮葡萄球菌多重耐藥株(multi-drug resistant strains)的發(fā)生率日趨增高,急需開發(fā)新型的抗葡萄球菌感染的藥物,尤其是能有效殺傷生物膜包被細(xì)菌的抗生素。 本課題建立在本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)現(xiàn)針對(duì)表皮葡萄球菌YycFG雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)組氨酸激酶YycG小分子抑制劑的基礎(chǔ)上,具體工作內(nèi)容分三部分：第一部分通過與南京工業(yè)大學(xué)合作,對(duì)小分子抑制劑Compound 2和Compound 5進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,檢測(cè)衍生物抗菌殺菌活性；第二部分檢測(cè)衍生物對(duì)早期生物膜進(jìn)一步形成的抑制活性及對(duì)成熟生物膜內(nèi)細(xì)菌的殺傷作用；第三部分初步研究了衍生物與表皮葡萄球菌組氨酸激酶的相互作用機(jī)制,并檢測(cè)了衍生物細(xì)胞毒性和溶血性。 第一部分表皮葡萄球菌YycG小分子抑制劑改造及衍生物抗菌活性的研究 細(xì)菌的雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)廣泛存在于革蘭陽(yáng)性和陰性細(xì)菌中,參與調(diào)控很多重要的生理功能,并且與很多病原菌的毒力和致病性密切相關(guān),因而被認(rèn)為是潛在的藥物靶標(biāo)。實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用生物信息學(xué)分析在表皮葡萄球菌全基因組中共發(fā)現(xiàn)了16對(duì)雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),功能預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)大部分雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)參與調(diào)控細(xì)菌離子交換、胞外蛋白分泌、黏附和自溶等重要的生理功能,其中有兩對(duì)雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)YycG/YycF和YhcS/YhcR調(diào)控細(xì)菌生長(zhǎng)。以組氨酸激酶YycG的保守功能域HATPase_c為靶標(biāo),計(jì)算機(jī)模擬重建其功能域的三維結(jié)構(gòu)并在此基礎(chǔ)上運(yùn)用高通量虛擬篩選技術(shù),隨后通過生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)5個(gè)小分子抑制物(先導(dǎo)化合物)。 本研究在YycG組氨酸激酶小分子抑制劑Compound 2 5的基礎(chǔ)之上,與南京工業(yè)大學(xué)的合作,通過藥物化學(xué)分子設(shè)計(jì)原理對(duì)化合物優(yōu)化改造,將活性基團(tuán)拼接原理應(yīng)用于藥物分子的設(shè)計(jì)合成�；趯�(duì)雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的了解和對(duì)靶蛋白YycG組氨酸激酶功能域的結(jié)構(gòu)分析,對(duì)篩選出的先導(dǎo)化合物原型和活性基團(tuán)進(jìn)行相關(guān)的分析之后,通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)將已知的作用于不同靶點(diǎn)且對(duì)藥物分子活性有重要影響的基團(tuán)或化合物片段進(jìn)行合理拼接,在保留藥理活性化合物噻唑烷酮母核的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)并引入一系列活性片段,產(chǎn)生活性更高、作用更廣泛或毒性更低的新化合物實(shí)體(new chemical entities, NCE)。合成了相關(guān)關(guān)鍵活性基團(tuán)變化的衍生物共81個(gè)(Compound 2衍生物46個(gè),Compound 5衍生物35個(gè))并完成該系列衍生物分離純化及其理化性質(zhì)表征。繼而通過對(duì)化合衍生物進(jìn)行活性篩選,確定衍生物的藥理活性,并依據(jù)生物學(xué)活性結(jié)果,開展進(jìn)一步的優(yōu)化改造和活性篩選。 抗菌試驗(yàn)結(jié)果顯示,81個(gè)衍生物中13個(gè)具有較好抑菌殺菌活性：Compound2的衍生物H2-10、H2-12、H2-20、H2-27、H2-28、H2-29和H2-30; Compound5的衍生物H5-10、H5-13、H5-22、H5-23、H5-24、H5-25。其中H2-28的MIC濃度達(dá)到3.125μM,H2-27和H2-29的MIC濃度也達(dá)到6.25μM,均優(yōu)于原型(Compound 2的MIC為50μM)。Compound 5的衍生物H5-10的MIC濃度也達(dá)到3.125μM,優(yōu)于原型(Compound 5的MIC為6.25μM)。并分別檢測(cè)了Compound 2和Compound 5衍生物對(duì)浮游細(xì)菌的殺傷能力,發(fā)現(xiàn)衍生物的最小殺菌濃度(MBC)同樣優(yōu)于原型(Compound 2和Compound 5)。 第二部分表皮葡萄球菌YycG小分子抑制劑衍生物抗生物膜活性的研究 生物膜能夠增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)藥物的抵抗能力,本研究在證實(shí)衍生物能有效抑制及殺傷浮游細(xì)菌的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步檢測(cè)了衍生物對(duì)早期生物膜進(jìn)一步形成的抑制作用以及對(duì)成熟生物膜內(nèi)細(xì)菌的殺傷作用。 首先檢測(cè)衍生物對(duì)早期生物膜(6h生物膜)進(jìn)一步形成的抑制作用,發(fā)現(xiàn)衍生物均能抑制表皮葡萄球菌生物膜的進(jìn)一步形成(抑制生物膜形成的最低有效藥物濃度范圍在12.5～100μM),其中抑制生物膜活性最好為Compound 2衍生物H2-20、H2-28、H2-29在12.5μM濃度就能完全抑制生物膜形成,抑制生物膜活性優(yōu)于原型(100μM)。 檢測(cè)衍生物對(duì)成熟生物膜(24h生物膜)的影響,首先觀察了衍生物對(duì)于24h生物膜肉眼形態(tài)的影響,實(shí)驗(yàn)顯示生物膜形態(tài)無變化,但Live-Dead染色后激光共聚焦顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)生物膜內(nèi)的細(xì)菌均被衍生物能殺傷,且衍生物對(duì)生物膜內(nèi)的細(xì)菌的殺傷效果明顯優(yōu)于萬古霉素,也明顯優(yōu)于原型。 第三部分表皮葡萄球菌YycG小分子抑制劑衍生物抑制YycG蛋白酶活性研究 通過生物學(xué)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)衍生物具有良好的抑菌殺菌活性,且能夠抑制早期生物膜的形成及殺傷成熟生物膜內(nèi)的細(xì)菌,活性均優(yōu)于原型Compound 2和Compound 5。原型均以表皮葡萄球菌YycFG雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)組氨酸激酶YycG蛋白的保守功能域HATPase_c為靶標(biāo)。衍生物是基于對(duì)靶蛋白YycG組氨酸激酶功能域的結(jié)構(gòu)分析,對(duì)篩選出的先導(dǎo)化合物原型和活性基團(tuán)進(jìn)行相關(guān)的分析之后,通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)將已知的作用于不同靶點(diǎn)且對(duì)藥物分子活性有重要影響的基團(tuán)或化合物片段進(jìn)行合理拼接,在保留藥理活性化合物噻唑烷酮母核的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)并引入一系列活性片段而產(chǎn)生的新化合物,其靶標(biāo)依然是組氨酸激酶YycG蛋白的保守功能域HATPase_c。通過體外磷酸化抑制實(shí)驗(yàn),證實(shí)衍生物能不同程度的抑制靶蛋白的磷酸化活性(半數(shù)抑制率濃度IC50值范圍在22.15～88.35μM),說明小分子抑制物衍生物的靶標(biāo)依然是組氨酸激酶YycG的保守功能域HATPase_c。 為研究YycG抑制劑衍生物如何與靶標(biāo)相互作用而發(fā)揮抑菌殺菌作用的機(jī)制,需分析衍生物與YycG蛋白相互作用的氨基酸位點(diǎn)。其具體途徑有兩個(gè)：1,通過化合物對(duì)細(xì)菌的壓力篩選,得到耐藥株,然后對(duì)耐藥株編碼YycG蛋白的保守功能域HATPase_c的基因片段進(jìn)行測(cè)序,尋找的突變氨基酸位點(diǎn)；2,通過分子生物學(xué)和生物信息學(xué)方法對(duì)YycG蛋白的保守功能域HATPase_c與化合物的作用位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè),對(duì)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變后表達(dá)蛋白,檢測(cè)小分子化合物對(duì)蛋白磷酸化活性抑制作用的變化,從而從分子水平上闡明小分子化合物的作用機(jī)制。 此外,我們研究了小分子抑制劑衍生物的細(xì)胞毒性和溶血活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示這些小分子抑制物衍生物在MIC濃度和最高檢測(cè)濃度(200μM)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Vero細(xì)胞)均無細(xì)胞毒性(MTT法),而原型Compound 2對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Vero細(xì)胞)有細(xì)胞毒性(其IC50值為96μM),說明化合物結(jié)構(gòu)改造后毒性降低。同時(shí)檢測(cè)了小分子抑制劑衍生物對(duì)健康人紅細(xì)胞的溶血活性,在MIC濃度所有衍生物均無溶血,在四倍MIC濃度時(shí)也僅有H2-10有輕微溶血,甚至在最高檢測(cè)濃度200μM, H2-20、H2-27、H2-28及H2-30的溶血作用仍然低于1%,說明結(jié)構(gòu)改造獲得的衍生物溶血性進(jìn)一步降低。 以上結(jié)果顯示,通過對(duì)YycG小分子抑制劑的活性集團(tuán)進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)后,得到的衍生物抑菌殺菌活性、抑制生物膜形成和殺傷生物膜內(nèi)細(xì)菌能力明顯更強(qiáng),同時(shí)細(xì)胞毒性和溶血活性下降,其靶標(biāo)依然是YycG蛋白的保守功能域HATPase_c。本研究對(duì)研發(fā)應(yīng)用于臨床的藥物具有重要意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R378.1

【共引文獻(xiàn)】

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1 Smruti Pushalkar;Xin Li;Zoya Kurago;Lalitha V Ramanathapuram;Satoko Matsumura;Kenneth E Fleisher;Robert Glickman;Wenbo Yan;Yihong Li;Deepak Saxena;;Oral microbiota and host innate immune response in bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw[J];International Journal of Oral Science;2014年04期

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本文編號(hào)：1740769